La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable
Summary
La capacidad de producir transgenes de<em> Caenorhabditis elegans</em> Utilizando ADN genómico realizado por fosmids es particularmente atractivo ya que todos los elementos de regulación nativos se mantienen. Descrito es un procedimiento sencillo y robusto para la producción de transgenes a través de recombinería con la<em> GALK</em> Marcador de selección.
Abstract
La creación de animales transgénicos se utiliza ampliamente en C. elegans de investigación, incluyendo el uso de proteínas de fusión GFP para estudiar la regulación y el patrón de expresión de genes de interés o de generación de purificación por afinidad en tándem (TAP) etiquetados versiones de genes específicos para facilitar su purificación. Normalmente, los transgénicos son generados por la colocación de un promotor aguas arriba de un gen reportero GFP o cDNA de interés, y esto a menudo produce un patrón de expresión representativa. Sin embargo, los elementos críticos de la regulación génica, tales como elementos de control en la región 3 'no traducida o promotores alternativos, podría perderse por este enfoque. Además sólo una variante de empalme solo puede ser estudiado por lo general por este medio. En contraste, el uso del ADN del gusano genómico realizado por clones de ADN fosmid probablemente incluye a la mayoría si no todos los elementos que intervienen en la regulación génica in vivo que permite la mayor capacidad de capturar el patrón de expresión genuina y el calendario. Para facilitar la generación de transgenes utilizando ADN fosmid, se describe una E. coli procedimiento basado en recombinería para insertar las buenas prácticas agrarias, un TAP-tag, u otras secuencias de interés en cualquier lugar en el gen. El procedimiento utiliza el gen GALK como el marcador de selección, tanto para los pasos de selección positiva y negativa en recombinería lo que se traduce en la obtención de la modificación deseada con gran eficiencia. Además, los plásmidos que contienen el gen GALK flanqueado por los brazos de homología con las buenas prácticas agrarias de uso común y TAP genes de fusión están disponibles que reducen el costo de oligos en un 50% cuando se genera una proteína de fusión GFP o TAP. Estos plásmidos utilizar el origen de replicación R6K que se opone a la necesidad de purificación extensa producto de la PCR. Por último, también demuestra una técnica para integrar el marcador unc-119 a la columna vertebral fosmid que permite que el fosmid que se inyecta directamente o bombardeados en gusanos para generar animales transgénicos. Este video muestra los procedimientos involucrados en la generación de un transgén por recombinería usando este método.
Protocol
Discussion
La generación de los transgenes de fosmids ofrece la ventaja de conservar todos los elementos promotor nativo, las variantes de empalme, y 3 'UTR elementos reguladores. Esto puede conducir a la construcción de un transgén que es más un reflejo de los patrones de expresión nativa, o la construcción de un transgén funcional cuando otros métodos fallan 5. Los transgenes resultante puede llevar a una variedad de etiquetas epítopo incluyendo GFP o una etiqueta de TAP.
La c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Lindsey Nash en busca de ayuda con el desarrollo de la técnica. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención AG028977 a ALF, una subvención para el proyecto piloto de la Universidad de Pittsburgh OAIC (AG024827), y los fondos de las semillas de la Universidad de Pittsburgh.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FosmidMAX kit | Epicentre | FMAX046 | ||
| GoTaq | Promega | M7122 | ||
| MOPS Media | Teknova | M2120 | ||
| 0.132 M Potassium phosphate solution | Teknova | M2102 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | ||
| 2-deoxygalactose | Sigma | D4407 | ||
| Biotin | Sigma | B4639 | ||
| Leucine | Sigma | L8000 | ||
| NH4Cl | Sigma | A9434 | ||
| Phusion DNA polymerase | NEB | F-530S | ||
| MacConkey agar base | Becton Dickinson | 281810 | ||
| Arabinose | Sigma | A3131 | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C1919 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | ||
| Glycerol | Sigma | G2025 | ||
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 |
References
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
- Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans. Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).
- Snow, M. I., Larsen, P. L. Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans. Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).
- Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA. J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lehrbach, N. J. LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans. Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).
- Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans. PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).
- Bamps, S., Hope, I. A. Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans. Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).
- Dolphin, C. T., Hope, I. A. Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones. Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).
- Sarov, M. A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).
- Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome. Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).
- Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. Genetic engineering using homologous recombination. Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).
- Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host. BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).
- Penfold, R. J., Pemberton, J. M. An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria. Gene. 118, 145-146 (1992).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Puig, O. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization. Development. 137, 1833-1842 (2010).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
