Produktionen av C. elegans Transgener via Recombineering med GalK Markör
Summary
Förmågan att producera transgener för<em> Caenorhabditis elegans</em> Använda genomisk DNA bärs av fosmids är särskilt attraktiva som alla infödda reglerande element behålls. Beskrivs är ett enkelt och stabilt förfarande för framställning av transgener via recombineering med<em> GalK</em> Markör.
Abstract
Skapandet av transgena djur är allmänt används i C. elegans forskning inklusive användningen av GFP fusionsproteiner att studera reglering och uttryck mönster av gener av intresse eller generering av tandem affinitet rening (TAP) taggade versioner av specifika gener för att underlätta deras rening. Normalt transgener genereras genom att placera en främjare före ett GFP reporter gen eller cDNA av intresse, och detta ger ofta ett representativt uttryck mönster. Men, kritiska delar av genreglering, såsom kontroll element i 3 'oöversatta regionen eller initiativtagare alternativ skulle kunna missas av denna strategi. Ytterligare en enda skarv variant kan oftast studeras på detta sätt. Däremot innefattar användning av masken arvsmassans DNA bärs av fosmid DNA-kloner sannolikt de flesta om inte alla element som ingår i genreglering in vivo som tillåter större förmåga att fånga det äkta uttrycket mönster och timing. För att underlätta skapandet av transgener använda fosmid DNA, beskriver vi ett E. coli baserade recombineering för att infoga GFP, en TAP-tagg eller andra sekvenser av intresse i någon plats i genen. Förfarandet använder galK genen som val markör för både positiva och negativa val steg i recombineering vilket resulterar i att få den önskade ändringen med hög verkningsgrad. Vidare plasmider innehåller galK genen flankerad av homologi vapen till vanliga GFP och TAP fusionsgener finns tillgängliga som minskar kostnaderna för oligos med 50% när du genererar en GFP eller TAP fusionsprotein. Dessa plasmider använda R6K replikering ursprung som utesluter behovet av omfattande PCR-produkt rening. Slutligen visar vi också en teknik för att integrera UNC-119 markör på den fosmid ryggrad som gör att fosmid vara direkt injiceras eller bombarderas med maskar för att skapa transgena djur. Denna video demonstrerar förfarandet i samband generera en transgen via recombineering med denna metod.
Protocol
Discussion
Den generation av transgener från fosmids erbjuder förmånen att behålla alla de infödda promotorn element, varianter skarva och 3 'UTR reglerande element. Detta kan leda till byggandet av en transgen som är mer reflekterande av de infödda uttryck mönster, eller byggandet av en funktionell transgen när andra metoder misslyckas 5. Den resulterande transgener kan bära en mängd olika epitop taggar inklusive GFP eller en TAP tagg.
Byggandet av transgener omfattat tre ste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Lindsey Nash för att få hjälp med att utveckla tekniken. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag AG028977 till ALF, ett pilotprojekt bidrag från University of Pittsburgh OAIC (AG024827) och medel frö från University of Pittsburgh.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FosmidMAX kit | Epicentre | FMAX046 | ||
| GoTaq | Promega | M7122 | ||
| MOPS Media | Teknova | M2120 | ||
| 0.132 M Potassium phosphate solution | Teknova | M2102 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | ||
| 2-deoxygalactose | Sigma | D4407 | ||
| Biotin | Sigma | B4639 | ||
| Leucine | Sigma | L8000 | ||
| NH4Cl | Sigma | A9434 | ||
| Phusion DNA polymerase | NEB | F-530S | ||
| MacConkey agar base | Becton Dickinson | 281810 | ||
| Arabinose | Sigma | A3131 | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C1919 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | ||
| Glycerol | Sigma | G2025 | ||
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 |
References
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
- Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans. Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).
- Snow, M. I., Larsen, P. L. Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans. Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).
- Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA. J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lehrbach, N. J. LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans. Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).
- Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans. PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).
- Bamps, S., Hope, I. A. Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans. Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).
- Dolphin, C. T., Hope, I. A. Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones. Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).
- Sarov, M. A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).
- Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome. Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).
- Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. Genetic engineering using homologous recombination. Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).
- Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host. BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).
- Penfold, R. J., Pemberton, J. M. An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria. Gene. 118, 145-146 (1992).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Puig, O. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization. Development. 137, 1833-1842 (2010).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
