高通量原位杂交方法表征在胎鼠下泌尿生殖道的基因表达模式
Summary
在这里，我们描述了一个高效的高吞吐量<em>原位</em>杂交（ISH）可视化mRNA的表达模式，在胎鼠的前列腺组织切片的方法。该方法可以很容易地适应可视化，在其他的鼠标组织或来自其他物种的组织的mRNA的表达模式。
Abstract
较低的泌尿生殖道（LUT）的发展是一个复杂的的过程。这种复杂性体现在从依赖雄激素信号和上皮-间质相互作用1,2胎儿男性尿道，前列腺的形成。了解前列腺发育的分子机制，可能揭示的增长是不恰当地从沉睡中苏醒过来，在以后的生活会引起良性前列腺增生和前列腺癌等前列腺疾病的机制。
发展LUT的解剖结构复杂。 16.5天的概念（DPC）的时间前列腺萌芽开始，许多类型的细胞存在。血管，神经和平滑肌驻留在间质的基质 3 。这间质围绕着一个多层的上皮细胞和引起胎儿通过雄激素受体 依赖旁分泌信号 4前列腺。身份的基质雄激素受体反应的前列腺癌的发展，针对这些基因的前列腺导管上皮形式尚不完全清楚的机制所需基因。能够准确地识别细胞类型和本地化内表达的具体因素是要进一步了解前列腺癌的发展。原位杂交（ISH）允许一个组织内mRNA的本地化。因此，这种方法可用于识别信号分子及其受体的表达模式和时间，从而阐明潜在的前列腺发育调节。
在这里，我们描述了一种高通量的原位杂交技术来识别在胎鼠LUT的使用振动切片机切段mRNA的表达模式。这种方法提供了比其他ISH的协议几个优点。执行上坚持一个幻灯片的超薄切片的原位杂交是技术上的困难;冰冻切片经常有结构质量差而冰冻切片和石蜡切片，往往会造成弱信号的分辨率。执行整装组织的ISH，可能会导致探头捕获。相比之下，我们的高通量技术采用厚切的部分，显示详细的组织架构。修改离心管允许在原位杂交的过程中容易处理的部分。 4 mRNA转录的一个最多可从一个单一的LUT高达24 mRNA的单次运行中检测到的成绩单17.5dpc筛选，从而降低成本和最大限度地提高效率。这种方法允许多个治疗组相同，并作为一个单元处理，从而消除任何解释数据的偏差。大多数有针对性地对前列腺的研究人员，这种方法提供了一个在胎鼠尿道前列腺导管网络，使人们产生低和高丰度的mRNA转录的空间和时间的位置。
Protocol
Discussion
使用这里介绍的方法，它可以检测到在所有主要类型的细胞和胎儿的雄性和雌性小鼠的LUT，包括间质垫，尿路上皮，平滑肌，前列腺芽，射精管，及阴道组织的车厢的mRNA。在本议定书中所使用的50μm的部分有足够厚，以解决组织架构（如血管）的优势，但足够薄，以避免探头诱捕，这是一个方法论的问题，在整个安装ISH普遍遭遇。每一个新的riboprobe评估阳性对照组织，染色已在先前发表的研究报?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者想感谢的技术援助，准备组织筐兰一，新泽西癌症研究所，博士。这项工作是由美国国立卫生赠款DK083425和DK070219研究院。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Applied Science | 11214667001 |
| Blocking reagent | Roche Applied Science | 11096176001 |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Applied Science | 11442074001 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Applied Science | 1277073910 |
| dNTPs | Roche Applied Science | 11969064001 |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 |
| Formamide | Sigma | F5786-1L |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma | G6257-100ML |
| Heparin, sodium salt | Sigma | H3393 |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 |
| Levamisole | Sigma | L9756 |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp. | 46551 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 |
| Maleic acid | Sigma | M0375-500G |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 |
| Polyester mesh, 33 micron, 12” x 24” | Small Parts Inc | CMY-0033-D |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase |
| RNase | Sigma | R6513 |
| RNase inhibitor | Roche Applied Science | 03335399001 |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega | M6101 |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza | 50101 |
| Sheep serum | Sigma | S2263-500mL |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | Millipore | SCGPU05RE |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 |
| SSC, 20X solution | Research Products International | S24022-4000.0 |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 |
| T7 RNA polymerase | Roche Applied Science | 10881767001 |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A |
| Yeast tRNA | Roche Applied Science | 109495 |
References
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