Yüksek Verimli In situ Hibridizasyon Yöntemi
Summary
Burada, biz verimli bir yüksek kapasiteli tarif<em> In situ</em> Fetal fare prostat doku bölümleri gelişmekte olan mRNA desenleri görselleştirmek için hibridizasyon (ISH) yöntemi. Bu yöntem diğer fare dokularda veya diğer türler dokularda mRNA ekspresyonu görselleştirmek için kolayca adapte olabilir.
Abstract
Alt üriner sistem (LUT) geliştirilmesi, karmaşık bir süreçtir. Bu karmaşıklık, androjenik sinyalleri ve etkileşimleri 1,2 epitelyal-mezenkimal dayanmaktadır fetal erkek üretra, prostat oluşumu sırasında kanıtlanmıştır . Prostat gelişiminde sorumlu olan moleküler mekanizmaların anlaşılması uygunsuz prostat, benign prostat hiperplazisi ve prostat kanseri gibi hastalıklara yol açmaları daha sonra yaşamın yeniden canlanmasına sebep oldu büyüme mekanizmalarının ortaya çıkarabilir.
Gelişmekte olan LUT anatomik olarak karmaşık. Tomurcuklanma zaman prostat 16.5 gün anlayışı (DPC) başlar, çok sayıda hücre tipleri mevcuttur. Damarları, sinirleri ve düz kas mezenkimal stroma 3 içinde bulunur. Bu çok katmanlı bir epitel stroma çevreleyen ve fetal androjen reseptör bağımlı parakrin sinyaller 4 ile prostata yol açmaktadır. Stromal androjen kimlik reseptör duyarlı prostat gelişiminde ve bu genlerin yanıt prostat duktal epitel formları tam olarak anlaşılmış değildir hangi mekanizma için gerekli olan genler. Yeteneği tam hücre tiplerinin tanımlanması ve bunların içindeki belirli faktörlerin ifade lokalize prostat gelişiminde daha fazla anlamak için şarttır. Situ hibridizasyon (ISH) bir doku içindeki mRNA'ların lokalizasyonu için izin verir . Böylece, bu yöntem ve böylece potansiyel prostat gelişim düzenleyiciler nedenlerine açıklık, desen ve sinyal molekülleri ve bunların reseptörleri ifade zamanlaması tanımlamak için kullanılır.
Burada, titreşimli mikrotom kesilmiş bölümler kullanarak fetal fare LUT mRNA desenleri tanımlamak için bir yüksek verim ISH tekniği açıklar. Bu yöntem diğer ISH protokolleri üzerinden birçok avantaj sunar. Bir slayt yapıştırılır ince bölümlerde ISH Sahne teknik olarak zor, hem cryosections ve parafin bölümleri genellikle zayıf sinyal çözünürlüğü neden cryosections sık sık kötü yapısal kalite var. Bütün montaj dokular üzerinde ISH Sahne prob yakalama neden olabilir. Buna karşın, yüksek kapasiteli tekniği ayrıntılı mimari dokusu ortaya kalın kesilmiş bölümler kullanır. Modifiye mikrofuge'de tüpler ISH prosedürü sırasında bölümleri kolay kullanım sağlar. Ve böylece maliyet, maksimum verimlilik azaltarak, maksimum 4 mRNA transkript kadar tek bir çalışma tespit edilen 24 mRNA transkript ile tek bir 17.5dpc LUT gösterildi. Bu yöntem, birden fazla tedavi gruplarında böylece verileri yorumlamak için herhangi bir önyargı çıkarırken, aynı ve tek bir birim olarak işlenen sağlar. En pertinently prostat araştırmacılar için, bu yöntem, düşük ve yüksek bolluk mRNA transkript prostat duktal ağ sebebiyet veren fetal fare üretra mekansal ve zamansal bir konum sağlar.
Protocol
Discussion
Burada anlatılan yöntemi kullanarak, tüm önemli hücre tipleri ve mezenkimal pedleri, ürotelium'un, düz kas, prostat tomurcukları, ejakülasyon kanalı ve vajina da dahil olmak üzere fetal erkek ve dişi fare LUT doku bölmeleri mRNA'ların tespit etmek mümkündür. Bu protokolde kullanılan 50μm bölümler, mimari dokusu (kan damarları gibi) çözmek için yeterli kalınlığa olmanın avantajı var ama yaygın tüm montaj ISH sırasında karşılaşılan metodolojik bir sorundur prob yakalama önlem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar doku sepet hazırlanmasında Dr Lan Yi, New Jersey Kanser Enstitüsü, teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibeler DK083425 ve DK070219 Enstitüleri tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Applied Science | 11214667001 |
| Blocking reagent | Roche Applied Science | 11096176001 |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Applied Science | 11442074001 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Applied Science | 1277073910 |
| dNTPs | Roche Applied Science | 11969064001 |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 |
| Formamide | Sigma | F5786-1L |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma | G6257-100ML |
| Heparin, sodium salt | Sigma | H3393 |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 |
| Levamisole | Sigma | L9756 |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp. | 46551 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 |
| Maleic acid | Sigma | M0375-500G |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 |
| Polyester mesh, 33 micron, 12” x 24” | Small Parts Inc | CMY-0033-D |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase |
| RNase | Sigma | R6513 |
| RNase inhibitor | Roche Applied Science | 03335399001 |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega | M6101 |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza | 50101 |
| Sheep serum | Sigma | S2263-500mL |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | Millipore | SCGPU05RE |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 |
| SSC, 20X solution | Research Products International | S24022-4000.0 |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 |
| T7 RNA polymerase | Roche Applied Science | 10881767001 |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A |
| Yeast tRNA | Roche Applied Science | 109495 |
References
- Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions–I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
- Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
- Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
- Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
