A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale
Summary
Qui, descriviamo un throughput efficiente alto<em> In situ</em> Ibridazione (ISH) metodo per la visualizzazione di modelli di espressione di mRNA nello sviluppo fetale del mouse sezioni di tessuto prostatico. Il metodo può essere facilmente adattato per visualizzare pattern di espressione di mRNA nei tessuti del mouse o in tessuti di altre specie.
Abstract
Lo sviluppo del basso tratto urogenitale (LUT) è un processo complesso. Questa complessità è evidenziato durante la formazione della prostata dall'uretra del feto maschio, che si basa sui segnali androgeni ed epiteliali-mesenchimali 1,2 interazioni. Comprensione dei meccanismi molecolari responsabili dello sviluppo della prostata può rivelare i meccanismi di crescita che sono impropriamente risvegliato più tardi nella vita per dare origine a malattie della prostata, come l'iperplasia prostatica benigna e cancro alla prostata.
La LUT via di sviluppo è anatomicamente complessa. Con il tempo prostatica in erba inizia a 16,5 dopo il concepimento giorni (DPC), numerosi tipi di cellule sono presenti. Vasi, nervi e muscolatura liscia soggiornare nel mesenchimali stroma 3. Questo stroma circonda un epitelio stratificato e dà luogo alla prostata del feto attraverso segnali paracrini recettore androgeno-dipendente 4. L'identità del stromali recettore androgeno-responsive geni necessari per lo sviluppo della prostata e il meccanismo con cui le forme della prostata dell'epitelio duttale in risposta a questi geni non è del tutto chiaro. La capacità di identificare con precisione i tipi di cellule e localizzare l'espressione di fattori specifici al loro interno è fondamentale per capire meglio lo sviluppo della prostata. Ibridazione in situ (ISH) consente per la localizzazione degli mRNA all'interno di un tessuto. Così, questo metodo può essere utilizzato per identificare modello e tempi di espressione di molecole di segnalazione e dei loro recettori, in modo da chiarire i regolatori della prostata potenziale di sviluppo.
Qui, descriviamo un elevato tecnica ISH throughput per individuare i pattern di espressione di mRNA nella LUT topo fetale mediante vibrazione microtomo taglio sezioni. Questo metodo offre diversi vantaggi rispetto ad altri protocolli ISH. L'esecuzione di ISH su sezioni sottili aderito a una diapositiva è tecnicamente difficile; criosezioni hanno spesso scarsa qualità strutturali, mentre sia criosezioni e sezioni di paraffina spesso sfociano nella risoluzione del segnale debole. L'esecuzione di ISH su tutta tessuti monte può causare intrappolamento sonda. Al contrario, la nostra tecnica utilizza un throughput elevato spessore taglio sezioni che rivelano l'architettura dettagliata dei tessuti. Tubi microcentrifuga modificato consentire un'agevole manipolazione delle sezioni durante la procedura ISH. Un massimo di 4 trascritti di mRNA può essere schermato da una LUT singolo 17.5dpc fino a 24 trascritti mRNA rilevato in un unico passaggio, riducendo così i costi e massimizzare l'efficienza. Questo metodo permette di gruppi di trattamento più da lavorare in modo identico e come una singola unità, eliminando ogni pregiudizio per l'interpretazione dei dati. La maggior parte pertinente per i ricercatori della prostata, questo metodo fornisce una posizione spaziale e temporale delle trascrizioni abbondanza bassa e alta mRNA nell'uretra topo fetale che dà origine alla rete prostata duttale.
Protocol
Discussion
Utilizzando il metodo descritto qui, è possibile rilevare mRNA in tutti i tipi di cellule importanti e compartimenti delle LUT fetale topo maschio e femmina anche le pastiglie mesenchimali, urotelio, muscolo liscio, germogli della prostata, del dotto eiaculatorio, e la vagina. Le sezioni di 50 micron utilizzati in questo protocollo hanno il vantaggio di essere abbastanza spessa per risolvere architettura dei tessuti (come i vasi sanguigni), ma sono abbastanza sottili per evitare di cattura della sonda, che è un proble…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Lan Yi, Cancer Institute del New Jersey, per l'assistenza tecnica nella preparazione di cestini dei tessuti. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Borse Salute DK083425 e DK070219.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Applied Science | 11214667001 |
| Blocking reagent | Roche Applied Science | 11096176001 |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Applied Science | 11442074001 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Applied Science | 1277073910 |
| dNTPs | Roche Applied Science | 11969064001 |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 |
| Formamide | Sigma | F5786-1L |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma | G6257-100ML |
| Heparin, sodium salt | Sigma | H3393 |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 |
| Levamisole | Sigma | L9756 |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp. | 46551 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 |
| Maleic acid | Sigma | M0375-500G |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 |
| Polyester mesh, 33 micron, 12” x 24” | Small Parts Inc | CMY-0033-D |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase |
| RNase | Sigma | R6513 |
| RNase inhibitor | Roche Applied Science | 03335399001 |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega | M6101 |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza | 50101 |
| Sheep serum | Sigma | S2263-500mL |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | Millipore | SCGPU05RE |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 |
| SSC, 20X solution | Research Products International | S24022-4000.0 |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 |
| T7 RNA polymerase | Roche Applied Science | 10881767001 |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A |
| Yeast tRNA | Roche Applied Science | 109495 |
References
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- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions–I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
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- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
