Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren
Summary
Hier beschreiben wir eine effiziente Hochdurchsatz-<em> In situ</em> Hybridisierung (ISH)-Methode zur Visualisierung von Mustern der mRNA-Expression in der Entwicklung fetalen Maus Prostatagewebe Abschnitten. Die Methode kann leicht angepasst werden, um mRNA-Expressionsmuster in anderen Maus Gewebe oder in Gewebe von anderen Arten zu visualisieren.
Abstract
Entwicklung des unteren Urogenitaltraktes (LUT) ist ein komplizierter Vorgang. Diese Komplexität wird während der Bildung der Prostata aus dem fötalen männlichen Harnröhre, die auf androgene Signale und epithelial-mesenchymale Interaktionen 1,2 stützt belegt. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die für Prostata-Entwicklung kann sich herausstellen, Wachstum Mechanismen, die unangemessen wiedererweckt werden später im Leben zu steigen, um Prostataerkrankungen, wie gutartige Prostata-Hyperplasie und Prostatakrebs geben.
Die Entwicklung von LUT ist anatomisch komplexer. Zu der Zeit, Prostata angehende beginnt auf 16,5 Tage nach der Empfängnis (DPC), sind zahlreiche Zelltypen vor. Gefäßsystem, Nerven und glatten Muskelzellen in den mesenchymalen Stromazellen 3 befinden. Das Stroma umgibt ein mehrschichtiges Epithel und gibt Anlass zu der fetalen Prostata durch Androgen-Rezeptor-abhängige parakrine Signale 4. Die Identität der Stroma-Androgen-Rezeptor-responsive Gene für Prostata-Entwicklung und der Mechanismus, mit dem Prostata-duktalen Epithel bildet in Reaktion auf diese Gene nicht vollständig verstanden erforderlich. Die Fähigkeit, genau zu identifizieren Zelltypen und zu lokalisieren Expression spezifischer Faktoren in ihnen ist zwingend notwendig, um weiter zu verstehen Prostata Entwicklung. In-situ-Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Lokalisierung von mRNAs in einem Gewebe. Somit kann diese Methode verwendet, um Muster und Timing der Expression von Signalmolekülen und ihren Rezeptoren zu identifizieren, damit die Aufklärung potenzieller Prostata Entwicklungsregulatoren werden.
Hier beschreiben wir einen hohen Durchsatz ISH Technik, um mRNA-Expressionsmuster in der fetalen Maus LUT mit vibrierenden Mikrotom-Zuschnitte zu identifizieren. Diese Methode bietet einige Vorteile gegenüber anderen ISH-Protokolle. Performing ISH am dünne Schnitte verklebt, um eine Folie ist technisch schwierig, Kryoschnitten haben häufig schlechte bauliche Qualität, während sowohl Gefrierschnitte und Paraffinschnitte oft in schwachen Signal Auflösung führen. Performing ISH auf whole mount Gewebe können in der Sonde Trapping führen. Im Gegensatz dazu nutzt unsere Hochdurchsatz-Technik dick geschnittenen Abschnitte, die detaillierte Gewebe Architektur offenbaren. Geändert Mikrozentrifugenröhrchen ermöglichen eine einfache Handhabung der Teile während der ISH Verfahren. Es können maximal 4 mRNA-Transkripte können von einem einzigen 17.5dpc LUT mit bis zu 24 mRNA-Transkripte in einem einzigen Durchlauf erkannt abgeschirmt werden, wodurch Kosten und Maximierung der Effizienz. Diese Methode ermöglicht es mehreren Behandlungsgruppen identisch und als eine Einheit verarbeitet werden, wodurch eine Tendenz für die Interpretation der Daten. Die meisten treffend für Prostata-Forscher, stellt diese Methode eine räumliche und zeitliche Lage der niedrigen und hohen Fülle mRNA-Transkripte in der fetalen Maus Harnröhre, die Anlass zu der Prostata duktalen Netzwerk.
Protocol
Discussion
Mit dem hier beschriebenen Verfahren ist es möglich, mRNAs in allen wichtigen Zelltypen und Gewebe Fächer des fetalen männlichen und weiblichen Mäusen LUTs inklusive der mesenchymalen Pads, Urothel, glatte Muskelzellen, Prostata-Knospen, Ductus ejaculatorius und Vagina zu erkennen. Der 50 um Abschnitte in diesem Protokoll haben den Vorteil, dass dick genug, um Gewebe-Architektur (z. B. Blutgefäße) zu lösen, sind aber dünn genug, um Sonde Trapping, die ein methodisches Problem häufig während der gesamten ISH-mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Lan Yi, Cancer Institute of New Jersey, um technische Unterstützung zu danken, bei der Vorbereitung Gewebe Körbe. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants DK083425 und DK070219 finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Applied Science | 11214667001 |
| Blocking reagent | Roche Applied Science | 11096176001 |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Applied Science | 11442074001 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Applied Science | 1277073910 |
| dNTPs | Roche Applied Science | 11969064001 |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 |
| Formamide | Sigma | F5786-1L |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma | G6257-100ML |
| Heparin, sodium salt | Sigma | H3393 |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 |
| Levamisole | Sigma | L9756 |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp. | 46551 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 |
| Maleic acid | Sigma | M0375-500G |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 |
| Polyester mesh, 33 micron, 12” x 24” | Small Parts Inc | CMY-0033-D |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase |
| RNase | Sigma | R6513 |
| RNase inhibitor | Roche Applied Science | 03335399001 |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega | M6101 |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza | 50101 |
| Sheep serum | Sigma | S2263-500mL |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | Millipore | SCGPU05RE |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 |
| SSC, 20X solution | Research Products International | S24022-4000.0 |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 |
| T7 RNA polymerase | Roche Applied Science | 10881767001 |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A |
| Yeast tRNA | Roche Applied Science | 109495 |
References
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- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions–I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
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- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
