Un alto rendimiento In situ Método de hibridación para caracterizar los patrones de expresión de ARNm en el ratón Fetal del tracto urogenital inferior
Summary
Aquí se describe un rendimiento de alta eficiencia<em> In situ</emHibridación> (ISH) método para la visualización de patrones de expresión de ARNm en el desarrollo fetal del ratón secciones de tejido de próstata. El método puede ser fácilmente adaptado para visualizar los patrones de expresión de ARNm en tejidos de ratón o en otros tejidos de otras especies.
Abstract
Desarrollo del tracto urogenital inferior (LUT) es un proceso complejo. Esta complejidad se pone de manifiesto durante la formación de la próstata desde la uretra masculina fetal, que se basa en las señales de andrógenos y epitelio-mesenquimal 1,2 interacciones. Comprender los mecanismos moleculares responsables del desarrollo de la próstata pueden revelar los mecanismos de crecimiento que están inadecuadamente despertado tarde en la vida para dar lugar a enfermedades de la próstata como la hiperplasia prostática benigna y cáncer de próstata.
La LUT en desarrollo es anatómicamente compleja. Por el momento incipiente de próstata comienza en 16,5 días después de la concepción (DPC), numerosos tipos de células están presentes. Vasos, nervios y el músculo liso de residencia en el estroma mesenquimal 3. Este estroma rodea un epitelio de varias capas y da lugar a la próstata del feto a través del receptor de andrógenos dependientes de las señales paracrinas 4. La identidad de la estroma del receptor de andrógenos que responden a los genes necesarios para el desarrollo de la próstata y el mecanismo por el cual la próstata formas epitelio ductal en respuesta a estos genes no se entiende completamente. La capacidad de identificar con precisión los tipos de células y localizar la expresión de factores específicos dentro de ellos es imprescindible para comprender mejor el desarrollo de la próstata. La hibridación in situ (ISH), permite la localización de los ARNm dentro de un tejido. Por lo tanto, este método puede ser utilizado para identificar patrón y el momento de la expresión de moléculas de señalización y sus receptores, con lo que los reguladores de dilucidar el potencial de desarrollo de próstata.
Aquí se describe una técnica de alto rendimiento ISH para identificar los patrones de expresión de ARNm en el LUT ratón fetal con vibración micrótomo secciones de corte. Este método ofrece varias ventajas sobre otros protocolos de ISH. Realización de ISH en secciones delgadas adherido a una diapositiva es técnicamente difícil, con frecuencia tienen cryosections calidad estructural de los pobres, mientras tanto cryosections y secciones de parafina a menudo resultan en la resolución de la señal es débil. Realización de ISH sobre todo tejidos de montaje puede resultar en la captura de la sonda. Por el contrario, nuestra técnica de alto rendimiento utiliza corte grueso secciones que muestran la arquitectura del tejido detallada. Modificado tubos de microcentrífuga permiten un fácil manejo de las secciones durante el procedimiento de ISH. Un máximo de 4 transcripciones de ARNm pueden ser examinados a partir de una sola LUT 17.5dpc con un máximo de 24 transcripciones de ARNm detectados en un solo plazo, reduciendo así costes y maximizar la eficiencia. Este método permite que varios grupos de tratamiento para ser procesado de forma idéntica y como una sola unidad, eliminando así cualquier sesgo de interpretación de los datos. Más pertinente para los investigadores de la próstata, este método proporciona una ubicación espacial y temporal de las transcripciones de ARNm de alta y baja abundancia en la uretra del ratón fetal que da lugar a la red de próstata ductal.
Protocol
Discussion
Utilizando el método descrito aquí, es posible detectar mRNAs en todos los principales tipos de células y los compartimentos de tejido de la LUT de ratón fetal hombres y mujeres incluyendo las pastillas de origen mesenquimal, urotelio, músculo liso, los brotes de próstata, conducto eyaculador y la vagina. Las secciones de 50 micras utilizado en este protocolo tiene la ventaja de ser lo suficientemente gruesa como para resolver la arquitectura del tejido (por ejemplo, los vasos sanguíneos), pero son lo suficientem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a la Dra. Lan Yi, Instituto del Cáncer de Nueva Jersey, para la asistencia técnica en la preparación de cestas de tejido. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones DK083425 y DK070219.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Applied Science | 11214667001 |
| Blocking reagent | Roche Applied Science | 11096176001 |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Applied Science | 11442074001 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Applied Science | 1277073910 |
| dNTPs | Roche Applied Science | 11969064001 |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 |
| Formamide | Sigma | F5786-1L |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma | G6257-100ML |
| Heparin, sodium salt | Sigma | H3393 |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 |
| Levamisole | Sigma | L9756 |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp. | 46551 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 |
| Maleic acid | Sigma | M0375-500G |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 |
| Polyester mesh, 33 micron, 12” x 24” | Small Parts Inc | CMY-0033-D |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase |
| RNase | Sigma | R6513 |
| RNase inhibitor | Roche Applied Science | 03335399001 |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega | M6101 |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza | 50101 |
| Sheep serum | Sigma | S2263-500mL |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | Millipore | SCGPU05RE |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 |
| SSC, 20X solution | Research Products International | S24022-4000.0 |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 |
| T7 RNA polymerase | Roche Applied Science | 10881767001 |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A |
| Yeast tRNA | Roche Applied Science | 109495 |
References
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- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
