Un débit élevé In situ pour caractériser les modes d'expression d'ARNm dans les fœtus de souris tractus urogénital
Summary
Ici, nous décrivons un débit à haute efficacité<em> In situ</emL'hybridation> (ISH) méthode pour visualiser les modèles de l'expression des ARNm dans le développement du fœtus de souris de la prostate sections de tissu. La méthode peut être facilement adapté à visualiser les profils d'expression des ARNm dans les tissus de la souris ou dans des tissus provenant d'autres espèces.
Abstract
Développement de la partie inférieure tractus urogénital (LUT) est un processus complexe. Cette complexité se manifeste lors de la formation de la prostate de l'urètre fœtus de sexe masculin, qui repose sur les signaux des androgènes et des épithélio-mésenchymateuse 1,2 interactions. Comprendre les mécanismes moléculaires responsables de l'élaboration de la prostate peut révéler des mécanismes de croissance qui sont mal réveillé tard dans la vie pour donner naissance à des maladies de la prostate tels que l'hyperplasie bénigne de la prostate et le cancer de la prostate.
Le LUT développement est anatomiquement complexes. Par la prostate de temps en herbe commence le jour après la conception 16.5 (DPC), de nombreux types cellulaires sont présents. Vascularisation, les nerfs et les muscles lisses résident dans le stroma mésenchymateux 3. Ce stroma entoure un épithélium multicouches et donne lieu à la prostate fœtale par androgènes dépendante du récepteur de signaux paracrines 4. L'identité de la stromales androgènes récepteurs réceptif gènes nécessaires pour le développement de la prostate et le mécanisme par lequel les formes de la prostate épithélium canalaire en réponse à ces gènes n'est pas entièrement comprise. La capacité à identifier précisément les types de cellules et de localiser l'expression de facteurs spécifiques en leur sein est impératif de mieux comprendre le développement de la prostate. L'hybridation in situ (ISH) permet pour la localisation des ARNm dans un tissu. Ainsi, cette méthode peut être utilisée pour identifier motif et le calendrier de l'expression de molécules de signalisation et leurs récepteurs, ce qui élucider les régulateurs de la prostate potentiel de développement.
Ici, nous décrivons une technique à haut débit ISH pour identifier les modèles d'expression d'ARNm dans la LUT fœtus de souris à l'aide vibrant microtome coupe sections. Cette méthode offre plusieurs avantages sur d'autres protocoles de l'ISH. Exécution ISH, sur coupes fines adhéré à une diapositive est techniquement difficile; cryocoupes ont souvent mauvaise qualité de la structure alors que les deux sections de paraffine et de cryocoupes aboutissent souvent à la résolution du signal faible. Exécution ISH sur les tissus monture entier peut entraîner le piégeage de la sonde. En revanche, notre technique à haut débit utilise coupe épaisse sections qui révèlent l'architecture du tissu détaillés. Microtubes de modification permettre une manipulation facile des sections lors de la procédure ISH. Un maximum de 4 transcrits d'ARNm peut être projeté à partir d'un simple LUT 17.5dpc avec jusqu'à 24 transcrits d'ARNm détectés en un seul passage, réduisant ainsi les coûts et maximiser l'efficacité. Cette méthode permet de multiples groupes de traitement pour être traitées de façon identique et comme une seule unité, éliminant ainsi tout biais d'interprétation des données. La plupart des chercheurs de la prostate pertinemment, cette méthode fournit une localisation spatiale et temporelle de haute et basse transcrits d'ARNm abondance dans l'urètre fœtus de souris qui donne naissance au réseau de la prostate canalaire.
Protocol
Discussion
En utilisant la méthode décrite ici, il est possible de détecter des ARNm dans tous les principaux types de cellules et de tissus compartiments de l'LUT foetus de souris mâle et femelle, y compris les plaquettes mésenchymateuses, urothélium, muscle lisse, les bourgeons de la prostate, canal éjaculateur, et le vagin. Les sections 50 microns utilisé dans ce protocole ont l'avantage d'être assez épaisse pour résoudre l'architecture des tissus (tels que les vaisseaux sanguins), mais sont suffisamm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Lan Yi, Cancer Institute du New Jersey, de l'assistance technique dans la préparation de paniers de tissu. Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de subventions et de santé DK083425 DK070219.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Applied Science | 11214667001 |
| Blocking reagent | Roche Applied Science | 11096176001 |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Applied Science | 11442074001 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Applied Science | 1277073910 |
| dNTPs | Roche Applied Science | 11969064001 |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 |
| Formamide | Sigma | F5786-1L |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma | G6257-100ML |
| Heparin, sodium salt | Sigma | H3393 |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 |
| Levamisole | Sigma | L9756 |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp. | 46551 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 |
| Maleic acid | Sigma | M0375-500G |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 |
| Polyester mesh, 33 micron, 12” x 24” | Small Parts Inc | CMY-0033-D |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase |
| RNase | Sigma | R6513 |
| RNase inhibitor | Roche Applied Science | 03335399001 |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega | M6101 |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza | 50101 |
| Sheep serum | Sigma | S2263-500mL |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | Millipore | SCGPU05RE |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 |
| SSC, 20X solution | Research Products International | S24022-4000.0 |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 |
| T7 RNA polymerase | Roche Applied Science | 10881767001 |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A |
| Yeast tRNA | Roche Applied Science | 109495 |
References
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- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions–I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
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- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
