En hög genomströmning På plats Hybridisering metod för att karaktärisera mönster mRNA uttryck i fostrets Mouse Lägre urogenitalsystemet
Summary
Här beskriver vi en effektiv hög genomströmning<em> På plats</em> Hybridisering (ISH) metod för att visualisera mönster av mRNA uttryck i utvecklingen av fostrets mus sektioner prostatavävnad. Metoden kan lätt anpassas för att visualisera mönster mRNA uttryck i andra mus vävnader eller i vävnad från andra arter.
Abstract
Utveckling av den lägre urogenitalsystemet (LUT) är en invecklad process. Denna komplexitet styrks vid bildandet av prostata från fostrets manliga urinröret, som bygger på androgena signaler och epitelceller-mesenkymala interaktioner 1,2. Att förstå de molekylära mekanismer som ansvarar för prostata utveckling kan avslöja tillväxt mekanismer som olämpligt är återuppväckt senare i livet att ge upphov till prostata sjukdomar såsom godartad prostataförstoring och prostatacancer.
Utvecklingsländerna LUT är anatomiskt komplex. Vid tiden prostatahyperplasi spirande börjar på 16,5 dagar efter befruktningen (DPC), många celltyper är närvarande. Kärlsystemet, nerver och glatt muskulatur finns inom de mesenkymala stroma 3. Detta glatta omger en mångbottnad epitel och ger upphov till fostrets prostatan genom androgenreceptorn-beroende parakrina signaler 4. Identiteten på den stromaceller androgen receptor-lyhörd gener som behövs för prostata utveckling och den mekanism genom vilken prostata duktal epitel former som svar på dessa gener är inte helt klarlagd. Förmågan att exakt identifiera celltyper och lokalisera uttrycket av specifika faktorer inom dem är absolut nödvändigt att ytterligare förstå prostata utveckling. In situ hybridisering (ISH) möjliggör lokalisering av mRNA i en vävnad. Därför kan denna metod användas för att identifiera mönster och tidpunkten för uttryck av signalering molekyler och deras receptorer, och därigenom belysa potentiella prostata utvecklande tillsynsmyndigheter.
Här beskriver vi en hög teknik genomströmning ISH att identifiera mönster mRNA uttryck i fostrets musen LUT med vibrerande mikrotom-cut sektioner. Denna metod har flera fördelar jämfört med andra ISH protokoll. Utföra ISH på tunna delar iakttas en bild är tekniskt svårt, kryosnitt ofta har dålig strukturell kvalitet medan både kryosnitt och sektioner paraffin resulterar ofta i svag signal upplösning. Utföra ISH på hela berget vävnader kan resultera i sond svällning. Däremot använder vi hög genomströmning teknik tjockt skurna avsnitt som avslöjar detaljerad vävnad arkitektur. Ändrad mikrofugrör rör möjliggör enkel hantering av avsnitten under ISH förfarandet. Högst 4 mRNA transkript kan vara avskärmade från en enda 17.5dpc LUT med upp till 24 mRNA transkript detekteras i en enda körning, och därigenom minska kostnader och maximera effektiviteten. Denna metod gör att flera behandlingsgrupperna skall behandlas på samma sätt och som en enhet, och därmed undanröja någon bias för att tolka data. De flesta fog för prostata forskare, ger denna metod en tid och plats för låga och höga utskrifter överflöd mRNA i fostrets mus urinröret som ger upphov till prostatan duktal nätverk.
Protocol
Discussion
Med hjälp av metoden som beskrivs här, är det möjligt att upptäcka mRNA i alla de stora celltyper och fack vävnad av fostrets manliga och kvinnliga musen LUT inklusive mesenkymala kuddar, urotel, glatt muskulatur, prostata knoppar, ejaculatorius kanal, och vagina. Den 50μm avsnitten i detta protokoll har fördelen av att vara tjock nog för att lösa vävnad arkitektur (t.ex. blodkärl) men är tunna nog för att undvika sond fångst, vilket är ett metodologiskt problem som ofta uppstår under hela-fäste ISH. V…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka doktor Lan Yi, Cancer Institute i New Jersey, för tekniskt bistånd för att förbereda vävnad korgar. Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health bidrag DK083425 och DK070219.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Applied Science | 11214667001 |
| Blocking reagent | Roche Applied Science | 11096176001 |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Applied Science | 11442074001 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Applied Science | 1277073910 |
| dNTPs | Roche Applied Science | 11969064001 |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 |
| Formamide | Sigma | F5786-1L |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma | G6257-100ML |
| Heparin, sodium salt | Sigma | H3393 |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 |
| Levamisole | Sigma | L9756 |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp. | 46551 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 |
| Maleic acid | Sigma | M0375-500G |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 |
| Polyester mesh, 33 micron, 12” x 24” | Small Parts Inc | CMY-0033-D |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase |
| RNase | Sigma | R6513 |
| RNase inhibitor | Roche Applied Science | 03335399001 |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega | M6101 |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza | 50101 |
| Sheep serum | Sigma | S2263-500mL |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | Millipore | SCGPU05RE |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 |
| SSC, 20X solution | Research Products International | S24022-4000.0 |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 |
| T7 RNA polymerase | Roche Applied Science | 10881767001 |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A |
| Yeast tRNA | Roche Applied Science | 109495 |
References
- Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions–I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
- Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
- Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
- Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
