Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay
Summary
In dit protocol beschrijven we de ontleding van placenta van de muis op zwangerschap d10.5, gevolgd door isolatie van trofoblast cellen door een Percoll-gradiënt. Vervolgens demonstreren het gebruik van de geïsoleerde cellen in een Matrigel invasie assay.
Abstract
De placenta is verantwoordelijk voor het transport van voedingsstoffen, gassen en groeifactoren voor de foetus, alsmede de verwijdering van afvalstoffen. Zo defecten in ontwikkeling van de placenta belangrijke gevolgen voor de foetus en moeder en zijn een belangrijke oorzaak van embryonale letaliteit. De belangrijkste celtype van de foetale deel van de placenta de trofoblast. Primaire muis placenta trofoblastcellen een nuttig hulpmiddel om normale en abnormale ontwikkeling van de placenta, en in tegenstelling cellijnen kunnen worden geïsoleerd en gebruikt om trofoblast studeren in specifieke stadia van de zwangerschap. Daarnaast kunnen primaire kweken van trofoblast uit transgene muizen worden gebruikt om de rol van bepaalde genen in cellen van de placenta te bestuderen. De hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op de beschrijving door Thordarson et al.. 1, waarbij een Percoll-gradiënt wordt gebruikt om een relatief zuivere trofoblast celpopulatie verkrijgen van geïsoleerde muis placenta. Het is vergelijkbaar met de meer algemeend methoden voor menselijke trofoblast celisolatie 2-3. Zuiverheid kan worden bepaald door immunocytochemisch kleuren van de geïsoleerde cellen voor cytokeratine 7 4. Hier worden de geïsoleerde cellen geanalyseerd met een matrigel invasie assay te beoordelen trofoblast invasiviteit in vitro 5-6. De binnengedrongen cellen geanalyseerd door immunocytochemie en gekleurd voor tellen.
Protocol
Discussion
In deze video tonen we de isolatie van trofoblastcellen van de muis placenta. Vervolgens tonen een in vitro assay voor trofoblastinvasie. Met deze procedure een grotendeels, maar niet geheel, kan zuivere populatie trofoblastcellen worden verkregen. Als verdere zuiverheid vereist is, kan magnetische bead scheiding of flowcytometrie worden uitgevoerd, zoals is beschreven voor primaire humane trofoblastcellen. De juiste lengte van de collagenase dissociatiestap moet worden bepaald bij elk experiment en worden geleerd door …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de Creative Services team bedanken van de Universiteit van Missouri Academic Support Center, die geproduceerd deze video. Dit werk werd ondersteund door de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development van de National Institutes of Health, licentienummer HD055231
Materials
Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| 10x Medium 199 | 50ml | 1X |
| Hepes | 2.383 g | 0.02M |
| sodium bicarbonate | 0.42 g | 0.01M |
| Penicllin-Streptomycin | 5 mL | 100 U- 100 μg /ml |
| Sterile dH20 | to 500 mL |
Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| Wash Solution | 100 mL | |
| DNase | 1 vial (2000 U) | 20 U/mL |
| Collagenase | 100 mg | 125 digestion units/mL |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C9891 | This is Clostridium collagenase. Bovine pancreatic collagenase would likely work as well |
| NCTC-135 | Sigma | D4263 | Add FBS to 10% |
| Matrigel invasion chambers | BD Biosciences | 354481 | |
| 10x Medium 199 | Sigma | M9163 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| DNase | Sigma | D4263 | |
| 100 μm Cell strainer | Fisher | 22363549 | |
| Antibody to cytokeratin 7 | DAKO | M7018 | Used at 1:100 dilution |
Equipment
Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.
References
- Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion. Placenta. 8, 573-585 (1987).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Librach, C. L. 92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts. J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).
- Schulz, L. C., Widmaier, E. P. The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion. Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282, 2072-2075 (1998).
