בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast
Summary
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הנתיחה של placentae מהעכבר על ההריון d10.5, ואחרי הבידוד של תאי trophoblast באמצעות שיפוע Percoll. אז אנחנו מדגימים שימוש בתאים המבודדים בassay פלישת matrigel.
Abstract
השליה אחראית להובלה של חומרים מזינים, גזים וגורמי גדילה לעובר, כמו גם החיסול של פסולת. לכן, פגמים בהתפתחות שליה יש לו השלכות רבות על העובר ואמו, והם גורם עיקרי של הקטלניות עובריות. סוג התא העיקרי של החלק העוברי של השליה הוא trophoblast. תאי trophoblast שליה ראשוניים עכבר הם כלי שימושי לחקר התפתחות שליה רגילה ונורמלית, ולא כמו שורות תאים, עשוי להיות מבודדים ומשמשים ללמוד trophoblast בשלבים מסוימים של הריון. בנוסף, תרבויות העיקריות של trophoblast מעכברים מהונדסים עלולות לשמש כדי לחקור את תפקידם של גנים מסוימים בתאי שליה. הפרוטוקול המובא כאן מבוסס על התיאור של Thordarson et al. 1, שבו שיפוע percoll משמש להשגת אוכלוסיית תא trophoblast טהורה יחסית משליות עכבר בודדות. זה דומה לשימוש נרחב יותרשיטות ברה 2-3 בידוד תא trophoblast אנושיים. טוהר יכול להיות מוערך על ידי צביעת immunocytochemical של התאים המבודדים ל7 4 cytokeratin. הנה, התאים הבודדים לאחר מכן, נותחו באמצעות assay פלישה matrigel להעריך הפולשנות trophoblast במבחנת 5-6. התאים פלשו מנותחים immunocytochemistry ומוכתם לספירה.
Protocol
Discussion
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הבידוד של תאים משלית trophoblast העכבר. אז אנחנו מראים assay חוץ גופייה בפלישה לtrophoblast. שימוש בהליך זה, במידה רבה, אבל לא לגמרי, אוכלוסייה טהורה של תאי trophoblast ניתן להשיג. אם טוהר נוסף נדרש, הפרדה מגנטית חרוז או הזרימה cytometry יכול להתבצע, כפי שכבר תאר לת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לצוות השירותים יצירתיים באוניברסיטת מרכז תמיכה האקדמית מיזורי שהפיק בסרטון זה. עבודה זו נתמכה על ידי יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי לבריאות והתפתחות ילד האנושית של המכונים הלאומיים לבריאות, מספר מענק HD055231
Materials
Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| 10x Medium 199 | 50ml | 1X |
| Hepes | 2.383 g | 0.02M |
| sodium bicarbonate | 0.42 g | 0.01M |
| Penicllin-Streptomycin | 5 mL | 100 U- 100 μg /ml |
| Sterile dH20 | to 500 mL |
Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| Wash Solution | 100 mL | |
| DNase | 1 vial (2000 U) | 20 U/mL |
| Collagenase | 100 mg | 125 digestion units/mL |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C9891 | This is Clostridium collagenase. Bovine pancreatic collagenase would likely work as well |
| NCTC-135 | Sigma | D4263 | Add FBS to 10% |
| Matrigel invasion chambers | BD Biosciences | 354481 | |
| 10x Medium 199 | Sigma | M9163 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| DNase | Sigma | D4263 | |
| 100 μm Cell strainer | Fisher | 22363549 | |
| Antibody to cytokeratin 7 | DAKO | M7018 | Used at 1:100 dilution |
Equipment
Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.
References
- Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion. Placenta. 8, 573-585 (1987).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Librach, C. L. 92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts. J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).
- Schulz, L. C., Widmaier, E. P. The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion. Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282, 2072-2075 (1998).
