Isolamento di cellule primarie trofoblasto mouse e Invasion Assay trofoblasto
Summary
In questo protocollo, si descrive la dissezione placentae dal mouse sulla gravidanza D10.5, seguito da isolamento di cellule trofoblastiche mediante gradiente di Percoll. Abbiamo poi dimostrare l'utilizzo delle cellule isolate in un saggio di invasione Matrigel.
Abstract
La placenta è responsabile per il trasporto di sostanze nutritive, gas e fattori di crescita per il feto, nonché l'eliminazione dei rifiuti. Così, difetti di sviluppo della placenta hanno importanti conseguenze per il feto e la madre, e sono una delle principali cause di mortalità embrionale. Il tipo cellulare principale della porzione fetale della placenta è trofoblasto. Primarie trofoblasti placentari topo sono un utile strumento per studiare normale e anormale sviluppo placentare, ea differenza linee cellulari, possono essere isolati e utilizzati per studiare trofoblasto in determinate fasi della gravidanza. Inoltre, colture primarie di trofoblasto di topi transgenici possono essere utilizzati per studiare il ruolo di particolari geni in cellule placentari. Il protocollo qui presentato è basato sulla descrizione da Thordarson et al. 1, in cui viene utilizzato un gradiente Percoll per ottenere una popolazione di cellule relativamente puro trofoblasto da placente mouse isolato. È simile a utilizzare il più ampiamentemetodi per l'uomo d 2-3 isolamento cellulare trofoblasto. Purezza può essere valutata mediante colorazione immunocitochimica delle cellule isolate per citocheratina 7 4. Qui, le cellule isolate vengono quindi analizzati utilizzando un saggio di invasione matrigel a valutare invasività trofoblasto in vitro 5-6. Le cellule invase vengono analizzati mediante immunocitochimica e tinto per il conteggio.
Protocol
Discussion
In questo video, dimostriamo l'isolamento di cellule del trofoblasto della placenta mouse. Abbiamo poi mostrano un saggio in vitro per l'invasione del trofoblasto. Utilizzando questa procedura, una gran parte, ma non completamente, popolazione pura di cellule trofoblastiche può essere ottenuta. Se la purezza è necessario un ulteriore, separazione magnetica tallone o citometria di flusso potrebbe essere eseguita, come è stato descritto per primarie cellule trofoblastiche umane. La corretta lunghezza del passo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il team Creative Services presso l'Università del Missouri Centro di supporto accademico che ha prodotto questo video. Questo lavoro è stato sostenuto dal Kennedy Eunice Shriver National Institute of Child Development & Salute umana del National Institutes of Health, un numero di concessione HD055231
Materials
Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| 10x Medium 199 | 50ml | 1X |
| Hepes | 2.383 g | 0.02M |
| sodium bicarbonate | 0.42 g | 0.01M |
| Penicllin-Streptomycin | 5 mL | 100 U- 100 μg /ml |
| Sterile dH20 | to 500 mL |
Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| Wash Solution | 100 mL | |
| DNase | 1 vial (2000 U) | 20 U/mL |
| Collagenase | 100 mg | 125 digestion units/mL |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C9891 | This is Clostridium collagenase. Bovine pancreatic collagenase would likely work as well |
| NCTC-135 | Sigma | D4263 | Add FBS to 10% |
| Matrigel invasion chambers | BD Biosciences | 354481 | |
| 10x Medium 199 | Sigma | M9163 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| DNase | Sigma | D4263 | |
| 100 μm Cell strainer | Fisher | 22363549 | |
| Antibody to cytokeratin 7 | DAKO | M7018 | Used at 1:100 dilution |
Equipment
Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.
References
- Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion. Placenta. 8, 573-585 (1987).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Librach, C. L. 92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts. J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).
- Schulz, L. C., Widmaier, E. P. The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion. Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282, 2072-2075 (1998).
