El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto
Summary
En este protocolo, se describe la disección de placenta de ratón en el embarazo D10.5, seguido por el aislamiento de las células trofoblásticas utilizando un gradiente de Percoll. A continuación, demostrar el uso de las células aisladas en un ensayo de invasión de Matrigel.
Abstract
La placenta es responsable del transporte de nutrientes, gases y factores de crecimiento para el feto, así como la eliminación de los desechos. Por lo tanto, los defectos en el desarrollo placentario tienen importantes consecuencias para el feto y la madre, y son una causa principal de la letalidad embrionaria. El principal tipo de células de la parte fetal de la placenta es el trofoblasto. Las células primarias de ratón trofoblasto placentario son una herramienta útil para el estudio de desarrollo de la placenta normal y anormal, y a diferencia de las líneas celulares, se pueden aislar y utilizar para estudiar trofoblasto en etapas específicas del embarazo. Además, los cultivos primarios de trofoblasto de ratones transgénicos pueden ser utilizados para estudiar la función de genes particulares en células de la placenta. El protocolo presentado aquí se basa en la descripción por Thordarson et al. 1, en el que se utiliza un gradiente de Percoll para obtener una población de células relativamente puro trofoblasto de la placenta aislados de ratón. Es similar a utilizar el más ampliamentemétodos para 2-3 d aislamiento humano trofoblasto celular. Pureza puede ser evaluada por tinción inmunocitoquímica de las células aisladas para la citoqueratina 7 4. Aquí, las células aisladas se analizan entonces usando un ensayo de invasión de Matrigel para evaluar la invasividad del trofoblasto in vitro 5-6. Las células invadidas se analizaron mediante inmunocitoquímica y se tiñeron para el recuento.
Protocol
Discussion
En este video se demuestra el aislamiento de las células trofoblásticas de la placenta del ratón. Luego mostramos un ensayo in vitro para la invasión del trofoblasto. Usando este procedimiento, una gran parte, pero no totalmente, la población pura de células trofoblásticas se puede conseguir. Si se requiere mayor pureza, separación magnética perla o citometría de flujo se pudo realizar, como se ha descrito para las células trofoblásticas humanas primarias. La longitud adecuada de la etapa de colagenasa disoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean dar las gracias al equipo de Servicios Creativos de la Universidad de Missouri Centro de Apoyo Académico quien produjo este video. Este trabajo fue apoyado por el Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Development Humanos y de Salud de los Institutos Nacionales de Salud, el número de concesión HD055231
Materials
Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| 10x Medium 199 | 50ml | 1X |
| Hepes | 2.383 g | 0.02M |
| sodium bicarbonate | 0.42 g | 0.01M |
| Penicllin-Streptomycin | 5 mL | 100 U- 100 μg /ml |
| Sterile dH20 | to 500 mL |
Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| Wash Solution | 100 mL | |
| DNase | 1 vial (2000 U) | 20 U/mL |
| Collagenase | 100 mg | 125 digestion units/mL |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C9891 | This is Clostridium collagenase. Bovine pancreatic collagenase would likely work as well |
| NCTC-135 | Sigma | D4263 | Add FBS to 10% |
| Matrigel invasion chambers | BD Biosciences | 354481 | |
| 10x Medium 199 | Sigma | M9163 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| DNase | Sigma | D4263 | |
| 100 μm Cell strainer | Fisher | 22363549 | |
| Antibody to cytokeratin 7 | DAKO | M7018 | Used at 1:100 dilution |
Equipment
Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.
References
- Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion. Placenta. 8, 573-585 (1987).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Librach, C. L. 92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts. J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).
- Schulz, L. C., Widmaier, E. P. The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion. Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282, 2072-2075 (1998).
