В этом протоколе описываются вскрытие плаценты от мыши по беременности d10.5, с последующим выделением из клеток трофобласта с использованием градиента Percoll. Мы тогда продемонстрировать использование изолированных клеток в анализе вторжения матригель.
Плацента отвечает за транспортировку питательных веществ, газов и факторы роста плода, а также ликвидации отходов. Таким образом, дефекты развития плаценты иметь важные последствия для плода и матери, и являются одной из основных причин эмбриональной летальности. Основным типом клеток плода часть плаценты трофобласта. Первичный мыши плацентарных клеток трофобласта являются полезным инструментом для изучения нормального и аномального развития плаценты, и в отличие от клеточных линий, могут быть выделены и использованы для изучения трофобласта в определенных стадиях беременности. Кроме того, первичные культуры трофобласта от трансгенных мышей, может быть использован для изучения роли определенных генов в клетках плаценты. Протокол, представленные здесь, основаны на описании по Тордарсон и соавт. 1, в которой градиент Перколла используется для получения относительно чистого населения трофобласта клетки из плаценты изолированные мыши. Это похоже на более широкое использованиег методов человеческой 2-3 изолятор трофобласта. Чистота может быть оценена иммуноцитохимических окрашивания изолированных клеток для цитокератин 7 4. Здесь, изолированные клетки затем анализируются с помощью матригель анализа вторжения для оценки инвазивности трофобласта в пробирке 5-6. Вторглись в клетки анализируют иммуноцитохимия и витражи для подсчета.
В этом видео мы покажем, выделение клеток трофобласта от мыши плаценты. Затем мы показываем в пробирке для анализа трофобласта вторжения. Используя эту процедуру, в значительной степени, но не полностью, чистый населения клетки трофобласта могут быть получены. Если в дальнейшем чистот?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить творческий коллектив услуг в Университете Миссури Академический центр поддержки, кто создал это видео. Эта работа была поддержана Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и человеческого развития из Национального Института Здоровья, номер гранта HD055231
Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
Reagent | Amount | Final concentration |
10x Medium 199 | 50ml | 1X |
Hepes | 2.383 g | 0.02M |
sodium bicarbonate | 0.42 g | 0.01M |
Penicllin-Streptomycin | 5 mL | 100 U- 100 μg /ml |
Sterile dH20 | to 500 mL |
Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
Reagent | Amount | Final concentration |
Wash Solution | 100 mL | |
DNase | 1 vial (2000 U) | 20 U/mL |
Collagenase | 100 mg | 125 digestion units/mL |
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Collagenase | Sigma | C9891 | This is Clostridium collagenase. Bovine pancreatic collagenase would likely work as well |
NCTC-135 | Sigma | D4263 | Add FBS to 10% |
Matrigel invasion chambers | BD Biosciences | 354481 | |
10x Medium 199 | Sigma | M9163 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
DNase | Sigma | D4263 | |
100 μm Cell strainer | Fisher | 22363549 | |
Antibody to cytokeratin 7 | DAKO | M7018 | Used at 1:100 dilution |
Equipment
Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.