Изоляция первичной мышь клетки трофобласта и анализа трофобласта Вторжение
Summary
В этом протоколе описываются вскрытие плаценты от мыши по беременности d10.5, с последующим выделением из клеток трофобласта с использованием градиента Percoll. Мы тогда продемонстрировать использование изолированных клеток в анализе вторжения матригель.
Abstract
Плацента отвечает за транспортировку питательных веществ, газов и факторы роста плода, а также ликвидации отходов. Таким образом, дефекты развития плаценты иметь важные последствия для плода и матери, и являются одной из основных причин эмбриональной летальности. Основным типом клеток плода часть плаценты трофобласта. Первичный мыши плацентарных клеток трофобласта являются полезным инструментом для изучения нормального и аномального развития плаценты, и в отличие от клеточных линий, могут быть выделены и использованы для изучения трофобласта в определенных стадиях беременности. Кроме того, первичные культуры трофобласта от трансгенных мышей, может быть использован для изучения роли определенных генов в клетках плаценты. Протокол, представленные здесь, основаны на описании по Тордарсон и соавт. 1, в которой градиент Перколла используется для получения относительно чистого населения трофобласта клетки из плаценты изолированные мыши. Это похоже на более широкое использованиег методов человеческой 2-3 изолятор трофобласта. Чистота может быть оценена иммуноцитохимических окрашивания изолированных клеток для цитокератин 7 4. Здесь, изолированные клетки затем анализируются с помощью матригель анализа вторжения для оценки инвазивности трофобласта в пробирке 5-6. Вторглись в клетки анализируют иммуноцитохимия и витражи для подсчета.
Protocol
Discussion
В этом видео мы покажем, выделение клеток трофобласта от мыши плаценты. Затем мы показываем в пробирке для анализа трофобласта вторжения. Используя эту процедуру, в значительной степени, но не полностью, чистый населения клетки трофобласта могут быть получены. Если в дальнейшем чистот?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить творческий коллектив услуг в Университете Миссури Академический центр поддержки, кто создал это видео. Эта работа была поддержана Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и человеческого развития из Национального Института Здоровья, номер гранта HD055231
Materials
Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| 10x Medium 199 | 50ml | 1X |
| Hepes | 2.383 g | 0.02M |
| sodium bicarbonate | 0.42 g | 0.01M |
| Penicllin-Streptomycin | 5 mL | 100 U- 100 μg /ml |
| Sterile dH20 | to 500 mL |
Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| Wash Solution | 100 mL | |
| DNase | 1 vial (2000 U) | 20 U/mL |
| Collagenase | 100 mg | 125 digestion units/mL |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C9891 | This is Clostridium collagenase. Bovine pancreatic collagenase would likely work as well |
| NCTC-135 | Sigma | D4263 | Add FBS to 10% |
| Matrigel invasion chambers | BD Biosciences | 354481 | |
| 10x Medium 199 | Sigma | M9163 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| DNase | Sigma | D4263 | |
| 100 μm Cell strainer | Fisher | 22363549 | |
| Antibody to cytokeratin 7 | DAKO | M7018 | Used at 1:100 dilution |
Equipment
Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.
References
- Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion. Placenta. 8, 573-585 (1987).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Librach, C. L. 92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts. J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).
- Schulz, L. C., Widmaier, E. P. The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion. Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282, 2072-2075 (1998).
