Isolement des cellules trophoblastiques primaires de souris et le test invasion trophoblastique
Summary
Dans ce protocole, nous décrivons la dissection du placenta de la souris sur la grossesse D10.5, suivie de l'isolement des cellules trophoblastiques en utilisant un gradient de Percoll. Nous avons ensuite démontrer l'utilisation des cellules isolées dans un essai invasion matrigel.
Abstract
Le placenta est responsable du transport des nutriments, des gaz et des facteurs de croissance pour le fœtus, ainsi que l'élimination des déchets. Ainsi, des défauts dans le développement placentaire avoir des conséquences importantes pour le fœtus et la mère, et sont une cause majeure de la létalité embryonnaire. Le type cellulaire majeur de la portion fœtale du placenta est le trophoblaste. Des cellules primaires de souris trophoblastes placentaires sont un outil utile pour étudier le développement normal et anormal du placenta, et contrairement à des lignées cellulaires, peuvent être isolés et utilisés pour étudier trophoblaste à des étapes spécifiques de la grossesse. En outre, des cultures primaires de trophoblaste de souris transgéniques peuvent être utilisées pour étudier le rôle des gènes particuliers dans les cellules placentaires. Le protocole présenté ici est basée sur la description de Thordarson et al. 1, dans lequel un gradient de Percoll est utilisé pour obtenir une population de cellules du trophoblaste relativement pur de placenta de souris isolées. Il est semblable à l'utiliser plus largementméthodes d pour 2-3 trophoblaste humain isolement cellulaire. Pureté peut être évaluée par coloration immunocytochimique des cellules isolées pour la cytokératine 7 4. Ici, les cellules isolées sont ensuite analysés en utilisant un test invasion matrigel trophoblaste invasif pour évaluer in vitro 5-6. Les cellules envahies sont analysés par immunocytochimie et colorées pour le comptage.
Protocol
Discussion
Dans cette vidéo, nous démontrons l'isolement de cellules trophoblastiques du placenta de souris. Nous montrons ensuite un test in vitro pour l'invasion du trophoblaste. Grâce à cette procédure, une grande partie, mais pas entièrement, la population pure de cellules trophoblastiques peuvent être obtenues. Si la pureté supplémentaire est nécessaire, de séparation du talon magnétique ou cytométrie en flux peut être réalisée, comme cela a été décrit pour les cellules trophoblastiques primaires de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier l'équipe des services de création de l'Université de Missouri Centre de soutien scolaire qui a produit cette vidéo. Ce travail a été soutenu par la Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development de la National Institutes of Health, numéro d'obtention HD055231
Materials
Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| 10x Medium 199 | 50ml | 1X |
| Hepes | 2.383 g | 0.02M |
| sodium bicarbonate | 0.42 g | 0.01M |
| Penicllin-Streptomycin | 5 mL | 100 U- 100 μg /ml |
| Sterile dH20 | to 500 mL |
Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| Wash Solution | 100 mL | |
| DNase | 1 vial (2000 U) | 20 U/mL |
| Collagenase | 100 mg | 125 digestion units/mL |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C9891 | This is Clostridium collagenase. Bovine pancreatic collagenase would likely work as well |
| NCTC-135 | Sigma | D4263 | Add FBS to 10% |
| Matrigel invasion chambers | BD Biosciences | 354481 | |
| 10x Medium 199 | Sigma | M9163 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| DNase | Sigma | D4263 | |
| 100 μm Cell strainer | Fisher | 22363549 | |
| Antibody to cytokeratin 7 | DAKO | M7018 | Used at 1:100 dilution |
Equipment
Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.
References
- Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion. Placenta. 8, 573-585 (1987).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Librach, C. L. 92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts. J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).
- Schulz, L. C., Widmaier, E. P. The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion. Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282, 2072-2075 (1998).
