Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu
Summary
Bu protokol, biz bir Percoll gradyanı kullanılarak trofoblast hücrelerinin izolasyonu takiben gebelik d10.5 üzerinde fare plasenta diseksiyonu tarif. Daha sonra bir Matrigel işgali tayininde izole hücrelerin kullanımını göstermektedir.
Abstract
Plasenta fetusun besin, gazlar ve büyüme faktörlerinin taşıma yanı sıra, atıkların ortadan kaldırılması için sorumludur. Böylece, plasental gelişim kusurları, anne ve fetus için önemli sonuçları vardır ve embriyonik ölümcül önemli bir nedenidir. Plasenta fetal kısmının başlıca bir hücre türüdürler trofoblast olup. Birincil fare plasental trofoblast hücreleri normal ve anormal plasental geliştirme çalışmaları için yararlı bir araçtır, ve hücre çizgileri, farklı olarak, izole edilmiş ve hamilelik belirli aşamalarında trofoblast incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, transgenik fareler trofoblast primer kültürlerden plasental hücreleri içinde belirli genlerin rolü incelemek için kullanılabilir. Burada sunulan protokol Thordarson ve arkadaşları tarafından açıklama esas alınmaktadır. Bir Percoll gradient izole edilmiş fare plasentası gelen, saf bir trofoblast hücre popülasyonu elde etmek için kullanıldığı, 1,. Bu, daha yaygın olarak kullanmak için benzerİnsan trofoblast hücre izolasyonu 2-3 d yöntemleri. Saflık sitokeratin 7 4 için izole hücrelerin immünohistokimyasal boyama ile değerlendirilebilir. Burada, izole hücreler daha sonra in vitro 5-6 trofoblast invazivlik değerlendirmek için bir Matrigel işgali testi kullanılarak analiz edilmiştir. Işgal hücrelerin sayımı için immünsitokimya ve lekeli tarafından analiz edilir.
Protocol
Discussion
Bu video olarak, fare plasenta trofoblast hücrelerin izolasyonu göstermektedir. Biz sonra trofoblast invazyonu için in vitro deney göstermektedir. Bu prosedür kullanıldığında, büyük ölçüde tamamen olmasa da, trofoblast hücre saf nüfus elde edilebilir. Daha fazla saflık gerekli ise primer insan trofoblast hücreleri için tarif edildiği gibi, manyetik boncuk ayırma ya da akış sitometrisi, yapılabilmektedir. Kollajenaz ayrışma adımın doğru uzunluğu her bir deney ile tespit edilmeli ve deneyimi …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bu videoyu üretti Missouri Akademik Destek Merkezi Üniversitesi Yaratıcı Hizmetler ekibi teşekkür etmek isterdim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü, hibe sayısı HD055231 tarafından desteklenmiştir
Materials
Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| 10x Medium 199 | 50ml | 1X |
| Hepes | 2.383 g | 0.02M |
| sodium bicarbonate | 0.42 g | 0.01M |
| Penicllin-Streptomycin | 5 mL | 100 U- 100 μg /ml |
| Sterile dH20 | to 500 mL |
Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| Wash Solution | 100 mL | |
| DNase | 1 vial (2000 U) | 20 U/mL |
| Collagenase | 100 mg | 125 digestion units/mL |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C9891 | This is Clostridium collagenase. Bovine pancreatic collagenase would likely work as well |
| NCTC-135 | Sigma | D4263 | Add FBS to 10% |
| Matrigel invasion chambers | BD Biosciences | 354481 | |
| 10x Medium 199 | Sigma | M9163 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| DNase | Sigma | D4263 | |
| 100 μm Cell strainer | Fisher | 22363549 | |
| Antibody to cytokeratin 7 | DAKO | M7018 | Used at 1:100 dilution |
Equipment
Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.
References
- Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion. Placenta. 8, 573-585 (1987).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Librach, C. L. 92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts. J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).
- Schulz, L. C., Widmaier, E. P. The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion. Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282, 2072-2075 (1998).
