Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van Drosophila Weefsel
Summary
Onlangs high-throughput sequencing technologie is sterk toegenomen gevoeligheid van chromatine immunoprecipitatie (ChIP) experiment en gevraagd de toepassing ervan met behulp van gezuiverde cellen of weefsel ontleed. Hier hebben we een methode om af te bakenen ChIP techniek te gebruiken met<em> Drosophila</em> Weefsel waarin de endogene chromatine toestand in een goed gekarakteriseerd biologisch systeem te pakken.
Abstract
Epigenetica blijft een zich snel ontwikkelende veld dat bestudeert hoe de chromatine staat bijdraagt aan de differentiële genexpressie in verschillende celtypen in verschillende ontwikkelingsstadia. Epigenetische regelgeving draagt bij aan een breed spectrum van biologische processen, met inbegrip van cellulaire differentiatie tijdens de embryonale ontwikkeling en homeostase in de volwassenheid. Een kritische strategie in epigenetische studies is om te onderzoeken hoe verschillende histon modificaties en chromatine factoren genexpressie reguleren. Om dit aan te pakken, wordt chromatine immunoprecipitatie (ChIP) veel gebruikt om een momentopname van de vereniging van specifieke factoren met DNA in de cellen van belang te verkrijgen.
ChIP techniek maakt gebruik gewoonlijk gekweekte cellen als uitgangsmateriaal, dat kan worden verkregen in overvloed en homogeniteit reproduceerbaar te genereren. Er zijn echter verschillende nadelen: eerst het milieu cellen groeien in petrischaal verschilt van die in vivo, kan dusgeen afspiegeling van de endogene chromatine toestand van de cellen in een levend organisme. Ten tweede kunnen niet alle soorten van cellen gekweekt ex vivo. Er is slechts een beperkt aantal cellijnen, waarvan mensen genoeg materiaal ChIP assay verkrijgen.
Hier beschrijven we een methode om ChIP experiment met behulp van Drosophila weefsels te doen. Het uitgangsmateriaal wordt ontleed weefsel van een levend dier kan dus nauwkeurig de endogene chromatine weerspiegelen. Het aanpassingsvermogen van deze methode met veel verschillende soorten weefsels kunnen de onderzoekers om veel meer biologisch relevante vragen met betrekking tot epigenetische regulatie in vivo 1, 2 aan te pakken. De combinatie van deze methode met high-throughput sequencing (ChIP-volgende) zal verder kunnen de onderzoekers om een epigenomisch landschap te verkrijgen.
Protocol
Discussion
De veelzijdigheid van ChIP analyses die in dit protocol kan worden gebruikt op verschillende weefsels, die een kans om de chromatine staat te studeren in een biologisch relevante systeem biedt. ChIP experimenten met gekweekte cellen systemen geschikt uitvoeren omdat grote hoeveelheden cellen kunnen gemakkelijk worden verkregen. Echter, gekweekte cellen niet noodzakelijk cellen in een meercellige omgeving. Door het ontwikkelen van deze techniek met behulp van ontleed weefsel van levende dieren, kunnen we in op vele vrage…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Dr Keji Zhao's lab (NIH / NHLBI) bedanken voor hun hulp bij het verstrekken van sequencing resultaten. Wij zouden ook graag de UCSC genome project bedanken voor het gebruik van Genome Browser om in kaart gebracht sequencing leest te visualiseren.
Dit werk werd ondersteund door de R00HD055052 NIH Pathway to Independence Award en R01HD065816 van NICHD, de Lucile Parkard Foundation en de Johns Hopkins University start-up financiering voor XC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5′ exo–) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 |
|
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
