Kullanarak Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) Drosophila Doku
Summary
Son zamanlarda yüksek verimlilik sıralama teknolojisi büyük ölçüde Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) deney duyarlılığı artmış ve saflaştırılmış hücreleri veya disseke doku kullanarak uygulama açtı. İşte biz ChIP tekniği kullanılacak bir yöntem tasvir<em> Drosophila</emIyi karakterize biyolojik sisteminde endojen kromatin devleti ele alabilir> doku.
Abstract
Epigenetik hızla gelişen bir alan kalır kromatin devletin farklı gelişim aşamalarında farklı hücre tiplerinde farklı gen ifadesini nasıl katkıda çalışmaları. Epigenetik düzenleme yetişkinlikte embriyonik gelişimi ve homeostazı sırasında hücresel farklılaşma da dahil olmak üzere biyolojik süreçleri, geniş bir yelpazede katkıda bulunur. Epigenetik çalışmalar eleştirel bir strateji çeşitli histon modifikasyonları ve kromatin faktörleri gen ifadesinin düzenlenmesine nasıl incelemektir. Bu adres için, Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) ilgi hücrelerde DNA ile belirli faktörlerin dernek bir enstantane elde etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.
ChIP tekniği yaygın olarak tekrarlanabilir verileri oluşturmak için bolluk ve homojenlik elde edilebilir malzeme, başlangıç olarak kültür hücreleri kullanır. Bununla birlikte, birçok uyarılar vardır: İlk olarak, Petri tabağına hücrelerinin büyümesini ortamı, böylece, in vivo olarak farklı olan olabiliryaşayan bir organizma hücrelerin endojen kromatin devlet yansıtmamaktadır. İkinci olarak, hücreler değil, her türlü kültürü ex vivo olabilir. Insan ChIP tayini için yeterince malzeme edinebilecekleri hücre dizileri sadece sınırlı sayıda vardır.
Burada Drosophila dokuları kullanarak ChIP deney yapmak için bir yöntem tarif. Başlangıç malzemesi böylece doğru endojen kromatin devlet yansıtabilir, yaşayan bir hayvan dokusu diseke edilir. Dokusu çok farklı tipleri ile bu yöntemin uyum araştırmacılar biyolojik olarak daha bir çok in vivo 1, 2, epigenetik düzenleme konusunda ilgili soruları sağlayacaktır. Yüksek verimlilik sıralama (ChIP-seq) ile bu yöntemi birleştirerek daha araştırmacı bir epigenomic manzara elde sağlayacaktır.
Protocol
Discussion
Bu protokol tartışılan ChIP analizlerin çok yönlülüğü, biyolojik ilgili sistemde kromatin devletin bir çalışma olanağı sağlar, farklı dokular üzerindeki kullanılabilir. Kültüre sistemlerinden hücreleri kullanılarak ChIP deneyler hücrelerinin büyük miktarda kolayca elde edilebilir çünkü gerçekleştirmek için uygundur. Bununla birlikte, kültürlenmiş hücrelerde mutlaka bir çoklu-hücresel ortamda hücreleri göstermemektedir. Canlı hayvan disseke doku kullanarak bu tekniği geliştirerek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar sıralama sonuçları sağlayarak yardım ettikleri için Dr Keji Zhao'nun laboratuarı (NIH / NHLBI) teşekkür etmek istiyorum. Biz de eşlenen sıralama okur görselleştirmek için Genom Tarayıcı kullanımı için UCSC genom projesi teşekkür etmek istiyorum.
Bu çalışma start-up XC fon NICHD Lucile Parkard Vakfı ve Johns Hopkins Üniversitesi'nden Bağımsızlık Ödülü ve R01HD065816 için R00HD055052 NIH Pathway tarafından desteklenmektedir
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5′ exo–) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 |
|
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
