Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit Drosophila Gewebe
Summary
Kürzlich Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologie hat stark Empfindlichkeit von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Experiment erhöht und aufgefordert ihre Anwendung unter Verwendung von gereinigten Zellen oder Gewebe präpariert. Hier haben wir beschreiben eine Methode zur Chip-Technik mit nutzen<em> Drosophila</em> Gewebe, das den endogenen Chromatin Zustand in einem gut charakterisierten biologischen System adressieren kann.
Abstract
Epigenetik bleibt ein sich schnell entwickelndes Feld, das untersucht, wie das Chromatin Zustand zu differentiellen Genexpression in verschiedenen Zelltypen in verschiedenen Entwicklungsstadien beiträgt. Epigenetische Regulation trägt zu einem breiten Spektrum an biologischen Prozessen wie Zelldifferenzierung während der Embryonalentwicklung und Homöostase im Erwachsenenalter. Eine kritische Strategie in der epigenetischen Studien ist zu untersuchen, wie verschiedene Histon-Modifikationen und Chromatin Faktoren Genexpression zu regulieren. Um dieses Problem anzugehen, wird Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) weit verbreitet, um einen Schnappschuss des Vereins von besonderer Faktoren, die mit DNA in den Zellen von Interesse zu erhalten verwendet.
Chip-Technik häufig verwendet kultivierten Zellen als Ausgangsmaterial, das in Hülle und Fülle und Homogenität erhalten werden können, um reproduzierbare Daten zu generieren. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen: Erstens ist die Umgebung, um Zellen in Petri-Schale wachsen anders als in vivo, kann somitspiegeln nicht die endogenen Chromatin Zustand der Zellen in einem lebenden Organismus. Zweitens kann nicht alle Arten von Zellen ex vivo kultiviert werden. Es gibt nur eine begrenzte Anzahl von Zelllinien, von denen die Menschen genügend Material für die Chip-Assay erhalten können.
Hier beschreiben wir eine Methode, um ChIP Experiment mit Drosophila Gewebe zu tun. Das Ausgangsmaterial wird Gewebe aus dem lebenden Tier seziert, so kann genau die endogenen Chromatin Zustand. Die Anpassungsfähigkeit dieser Methode mit vielen verschiedenen Arten von Gewebe ermöglicht es Forschern, viel mehr biologisch relevanten Fragen rund um epigenetische Regulation in vivo 1, 2 anzugehen. Die Kombination dieser Methode mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) wird weiter Forschern erlauben, eine epigenomischen Landschaft zu erhalten.
Protocol
Discussion
Die Vielseitigkeit der Chip-Analysen in diesem Protokoll behandelt werden, können auf verschiedenen Geweben, die eine Gelegenheit, die Chromatin-Zustand in einer biologisch relevanten System zu studieren bietet eingesetzt werden. Chip-Experimenten unter Verwendung von Zellen aus kultivierten Systeme sind bequem durchgeführt werden, da große Menge von Zellen leicht erhalten werden kann. Jedoch nicht kultivierten Zellen nicht notwendigerweise Zellen in einem mehrzelligen Umgebung. Durch die Entwicklung dieser Technik m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Herrn Dr. Keji Zhaos Labor (NIH / NHLBI) für ihre Hilfe bei der Bereitstellung von Sequenzierung Ergebnisse danken. Wir möchten auch, um die UCSC Genom-Projekt für die Nutzung der Genom-Browser zu visualisieren abgebildet Sequenzierung liest danken.
Diese Arbeit wurde durch die NIH R00HD055052 Pathway worden zu Independence Award und R01HD065816 aus NICHD, der Lucile Parkard-Stiftung, und der Johns Hopkins University Anschubfinanzierung zu XC unterstützt
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5′ exo–) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 |
|
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
