Cromatina imunoprecipitação (CHIP), utilizando Drosophila Tecido
Summary
Recentemente high-throughput tecnologia de seqüenciamento aumentou muito a sensibilidade da cromatina imunoprecipitação (CHIP) experiência e levou o seu aplicativo usando células purificadas ou tecido dissecado. Aqui nós delinear um método para usar a técnica de chip com<em> Drosophila</em> Tecido, que pode tratar o estado da cromatina endógeno em um sistema bem caracterizada biológica.
Abstract
Epigenética continua a ser um campo de rápido desenvolvimento que estuda como o estado de cromatina contribui para a expressão diferencial de genes em tipos celulares distintos em diferentes estágios de desenvolvimento. Regulação epigenética contribui para um amplo espectro de processos biológicos, incluindo a diferenciação celular durante o desenvolvimento embrionário e homeostase na idade adulta. Uma estratégia fundamental em estudos epigenéticos é examinar como várias modificações de histonas e fatores de cromatina regular a expressão gênica. Para resolver isso, cromatina imunoprecipitação (CHIP) é amplamente utilizado para obter um instantâneo da associação de fatores particulares com DNA nas células de interesse.
Técnica ChIP geralmente usa células cultivadas como material de partida, que pode ser obtido em abundância e homogeneidade para gerar dados reprodutíveis. No entanto, existem várias advertências: Primeiro, o ambiente para crescer as células em placa de Petri é diferente do que in vivo, assim, podenão reflectem o estado da cromatina endógena de células de um organismo vivo. Em segundo lugar, nem todos os tipos de células podem ser cultivadas ex vivo. Há apenas um número limitado de linhas de células, a partir do qual as pessoas podem obter material suficiente para ensaio ChIP.
Aqui nós descrevemos um método para fazer experiência chip usando tecidos de Drosophila. O material de partida é dissecado de tecido de um animal vivo, assim com precisão pode reflectir o estado da cromatina endógena. A adaptabilidade deste método com muitos tipos diferentes de tecido irá permitir aos pesquisadores abordar muito mais perguntas biologicamente relevantes sobre regulação epigenética in vivo 1, 2. Combinando este método com alto rendimento de seqüenciamento (CHIP seq-) continuará a permitir que os investigadores de obter uma paisagem epigenômico.
Protocol
Discussion
A versatilidade do análises ChIP discutidos nesta protocolo pode ser utilizado em diferentes tecidos, o que proporciona uma oportunidade para estudar o estado de cromatina em um sistema biologicamente relevantes. Experimentos chip usando células a partir de sistemas de cultura são convenientes para realizar porque a grande quantidade de células pode ser facilmente obtida. No entanto, células de cultura não reflectem necessariamente células em um ambiente multi-celular. Ao desenvolver esta técnica usando tecido d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao laboratório do Dr. Keji Zhao (NIH / NHLBI) por sua ajuda no fornecimento de resultados de sequenciamento. Gostaríamos também de agradecer ao projeto genoma UCSC para o uso do navegador para visualizar o seqüenciamento do genoma mapeado lê.
Este trabalho foi apoiado pela Pathway NIH R00HD055052 para Prêmio Independência e R01HD065816 do NICHD, a Lucile Parkard Foundation, ea Johns Hopkins University start-up financiamento para XC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5′ exo–) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 |
|
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
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