Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP), utilizando Drosophila Tejido
Summary
Recientemente alto rendimiento de la tecnología de secuenciación ha aumentado considerablemente la sensibilidad de la cromatina immunoprecipitation (CHIP) y el experimento se le solicite su aplicación con células purificadas o tejidos disecados. Aquí delinear un método para usar la técnica con el chip<em> Drosophila</em> Tejido, que puede abordar el estado de la cromatina endógena en un sistema bien caracterizado biológica.
Abstract
Epigenética sigue siendo un campo de rápido desarrollo que estudia cómo el estado de la cromatina contribuye a la expresión diferencial de genes en distintos tipos de células en diferentes etapas de desarrollo. La regulación epigenética contribuye a un amplio espectro de procesos biológicos, incluyendo la diferenciación celular durante el desarrollo embrionario y la homeostasis en la edad adulta. Una estrategia de crítica en los estudios epigenéticos es examinar cómo diferentes modificaciones de las histonas y los factores de la cromatina regula la expresión génica. Para abordar esta, inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se utiliza ampliamente para obtener una instantánea de la asociación de factores particulares con el ADN en las células de interés.
Técnica chip comúnmente utiliza células cultivadas como material de partida, que puede obtenerse en abundancia y homogeneidad para generar datos reproducibles. Sin embargo, hay varias advertencias: En primer lugar, el medio para hacer crecer células en placas de Petri es diferente de la que in vivo, por lo tanto puedeno reflejan el estado de la cromatina endógena de las células en un organismo vivo. En segundo lugar, no todos los tipos de células pueden ser cultivadas ex vivo. Hay sólo un número limitado de líneas celulares, de los cuales la gente puede obtener suficiente material para chip de ensayo.
Aquí se describe un método para hacer experimentos chip usando tejidos de Drosophila. El material de partida se disecciona tejido de un animal vivo, con lo que puede reflejar con precisión el estado de la cromatina endógeno. La capacidad de adaptación de este método con muchos tipos diferentes de tejidos permitirá a los investigadores para hacer frente a una gran cantidad biológicamente más preguntas relevantes con respecto a la regulación epigenética en vivo 1 y 2. La combinación de este método con secuenciación de alto rendimiento (chip-ss) también permitirá a los investigadores para obtener un panorama epigenómico.
Protocol
Discussion
La versatilidad de los análisis de chip discutidos en este protocolo se puede utilizar en diferentes tejidos, lo que proporciona una oportunidad para estudiar el estado de la cromatina en un sistema biológicamente relevantes. Experimentos chip usando células cultivadas procedentes de sistemas son convenientes para llevar a cabo porque gran cantidad de células se pueden obtener fácilmente. Sin embargo, las células cultivadas no reflejan necesariamente las células en un entorno multi-celular. Mediante el desarrollo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer el laboratorio del Dr. Zhao Keji (NIH / NHLBI) por su ayuda en la provisión de resultados de la secuenciación. También nos gustaría dar las gracias al proyecto del genoma UCSC para el uso de Genoma del navegador para visualizar la secuencia asignada lee.
Este trabajo ha sido financiado por el Camino R00HD055052 NIH para el Premio de la Independencia y R01HD065816 de NICHD, la Fundación Lucile Parkard, y la Universidad Johns Hopkins, la puesta en marcha fondos para XC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5′ exo–) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 |
|
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
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