Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con Drosophila Tessuto
Summary
Recentemente high-throughput tecnologia di sequenziamento ha notevolmente aumentato la sensibilità di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) esperimento e ha spinto la sua applicazione con cellule purificate o tessuti sezionati. Qui delineare un metodo per usare la tecnica ChIP con<em> Drosophila</em> Tessuto, che può definire la condizione cromatina endogeno in un sistema ben caratterizzato biologico.
Abstract
L'epigenetica rimane un settore in rapida evoluzione che gli studi come lo stato della cromatina contribuisce alla espressione genica differenziale in diversi tipi di cellule a diversi stadi di sviluppo. Regolazione epigenetica contribuisce ad un ampio spettro di processi biologici, tra cui la differenziazione cellulare durante lo sviluppo embrionale e l'omeostasi in età adulta. Una strategia critico negli studi epigenetici è quello di esaminare come le varie modificazioni degli istoni e fattori di cromatina regolare l'espressione genica. Per risolvere questo problema, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è ampiamente utilizzato per ottenere una fotografia della associazione di fattori particolari con DNA nelle cellule di interesse.
ChIP tecnica utilizza comunemente cellule coltivate come materiale di partenza, che può essere ottenuto in abbondanza e omogeneità per generare dati riproducibili. Tuttavia, vi sono diversi avvertimenti: Innanzitutto, l'ambiente far crescere le cellule in piastre di Petri è diversa da quella in vivo, così puònon rispecchiano lo stato endogena cromatina delle cellule in un organismo vivente. In secondo luogo, non tutti i tipi di cellule possono essere coltivate ex vivo. Ci sono solo un numero limitato di linee cellulari, da cui la gente può ottenere abbastanza materiale per l'analisi ChIP.
Qui si descrive un metodo per fare esperimenti ChIP utilizzando tessuti di Drosophila. Il materiale di partenza è sezionato da un tessuto animale vivente, quindi in grado di rispecchiare con precisione lo stato endogena cromatina. L'adattabilità di questo metodo con diversi tipi di tessuto permetterà ai ricercatori di affrontare molto più biologicamente questioni rilevanti in materia di regolazione epigenetica in vivo 1, 2. Combinando questo metodo con high-throughput sequencing (ChIP-seq) ulteriormente permetterà ai ricercatori di ottenere un paesaggio epigenomic.
Protocol
Discussion
La versatilità di analisi ChIP discussi in questo protocollo può essere utilizzato su diversi tessuti, che fornisce l'opportunità di studiare lo stato cromatina in un sistema biologicamente rilevante. Esperimenti chip utilizzando cellule coltivate sono sistemi conveniente eseguire a causa grande quantità di cellule può essere ottenuto facilmente. Tuttavia, cellule coltivate non riflette necessariamente cellule in un multi-cellulare ambiente. Con lo sviluppo di questa tecnica usando tessuti sezionati da animali …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Keji Zhao lab (NIH / NHLBI) per il loro aiuto nel fornire i risultati di sequenziamento. Vorremmo anche ringraziare il progetto genoma UCSC per l'utilizzo di Browser per visualizzare sequenziamento del genoma mappato legge.
Questo lavoro è stato sostenuto dal Pathway R00HD055052 NIH al Premio Indipendenza e R01HD065816 dal NICHD, il Lucile Parkard Foundation, e la Johns Hopkins University di start-up fondi per XC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5′ exo–) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 |
|
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
