Kromatin Immunoutfällning (chip) med användning av Drosophila Vävnad
Summary
Nyligen high-throughput sekvensering teknik har ökat kraftigt känslighet Chromatin Immunoprecipitation (chip) experiment och till grund för dess tillämpning med renade celler eller dissekeras vävnad. Här har vi avgränsa en metod att använda ChIP teknik med<em> Drosophila</em> Vävnad, som kan klara den endogena kromatinet tillstånd i en väldefinierad biologiskt system.
Abstract
Epigenetik är en snabbt växande fält som studerar hur kromatin staten bidrar till differentiell genuttryck i olika celltyper i olika utvecklingsstadier. Epigenetisk reglering bidrar till ett brett spektrum av biologiska processer, inbegripet cellplattor differentiering under fosterutvecklingen homeostas i vuxen ålder. En kritisk strategi i epigenetiska studier är att undersöka hur olika histon modifikationer och kromatin faktorer reglerar genuttryck. För att lösa detta är Chromatin Immunoprecipitation (chip) används allmänt för att få en ögonblicksbild av föreningen av särskilda faktorer som DNA i cellerna av intresse.
ChIP teknik använder vanligen odlade celler som utgångsmaterial, vilka kan erhållas i överflöd och homogenitet för att generera reproducerbara data. Det finns emellertid flera förbehåll: För det första är den miljö att växa celler i Petri-skål som skiljer sig från in vivo, vilket kaninte återspeglar den endogena kromatinet tillståndet av celler i en levande organism. För det andra kan inte alla typer av celler vara odlade ex vivo. Det finns bara ett begränsat antal cellinjer, från vilken människor kan få tillräckligt med material för ChIP analys.
Här beskriver vi en metod för att göra ChIP experiment med Drosophila vävnader. Utgångsmaterialet dissekeras vävnad från ett levande djur, vilket exakt kan reflektera den endogena kromatin staten. Anpassningsförmåga denna metod med många olika typer av vävnad kommer att tillåta forskare att ta itu med en mycket mer biologiskt relevanta frågor om epigenetisk reglering in vivo 1, 2. Genom att kombinera denna metod med hög genomströmning sekvensering (chip-punkter) kommer ytterligare att låta forskare för att få en epigenomiska landskap.
Protocol
Discussion
Mångsidigheten av chip analyser som diskuteras i detta protokoll kan användas på olika vävnader, vilket ger en möjlighet att studera kromatinet staten i ett biologiskt relevant system. CHIP experiment med användning av celler från odlade system är bekvämt att utföra eftersom stora mängder av celler kan lätt erhållas. Däremot odlade celler inte nödvändigtvis celler i en multi-cellulär miljö. Genom att utveckla denna teknik använder dissekeras vävnad från levande djur, kan vi ta itu med många frågor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Keji Zhao labb (NIH / NHLBI) för deras hjälp att ge sekvensering resultat. Vi vill också tacka UCSC Genome Project för användning av Genome Browser för att visualisera kartlagt sekvensering läser.
Detta arbete har fått stöd av R00HD055052 NIH vägen till Independence Award och R01HD065816 från NICHD den Lucile Parkard Foundation och Johns Hopkins University startbidrag till XC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5′ exo–) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 |
|
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
