Langsigtet, høj opløsning Konfokal Time Lapse Imaging af<em> Arabidopsis Kimblad</em> Epidermis under spiring
Summary
Vi beskriver en protokol med kammer dias og medier til at immobilisere plante kimbladene for konfokal afbildning af epidermis over flere dages udvikling, som dokumenterer stomatal differentiering. Fluorophor-mærkede proteiner kan spores dynamisk ved ekspression og subcellulær lokalisering, øget forståelse for deres mulige roller ved celledeling og celle-type differentiering.
Abstract
Imaging in vivo dynamik cellulær adfærd gennem en udviklingsmæssig sekvens kan være en kraftfuld teknik til at forstå mekanikken i væv mønster. Under animalsk udvikling forekommer centrale celleproliferation og mønsterdannende begivenheder meget hurtigt. For eksempel alle de celledelinger nødvendige for larvestadiet krop planen i Caenorhabditis elegans er afsluttet inden for seks timer efter befrugtningen, med syv mitotiske cyklus 1; de seksten eller flere mitose af Drosophila embryogenese forekommer hos mindre end 24 timer 2. I modsætning hertil er celledelinger under plantens udvikling langsom, typisk i størrelsesordenen af en dag 3,4,5. Dette indebærer en enestående udfordring og et behov for langsigtet direkte billedvisning til at dokumentere dynamiske opførsler af celledeling og differentiering begivenheder i løbet plante organogenesen. Arabidopsis epidermis er en fremragende model system til undersøgelsesdommere signalering, celle skæbne og udvikling i planter. I kotyledonen består dette væv af luft-og vand-resistente fortovet celler spækket med jævnt fordelt stomata, ventiler, der åbner og lukker for at kontrollere gasudveksling og vandtab. Korrekt afstand af disse stomata er kritisk for deres funktion, og deres udvikling følger en sekvens af asymmetrisk opdeling og celledifferentiering trin til at producere den organiserede epidermis (fig. 1).
Denne protokol tillader observation af celler og proteiner i epidermis over flere dage for udvikling. Denne tidsramme gør præcis dokumentation af stamcelle divisioner og differentiering af epidermale celler, herunder stomata og epidermale fortov celler. Fluorescerende proteiner kan fusioneres til proteiner af interesse at vurdere deres dynamik ved celledeling og differentieringsprocesser. Denne teknik gør det muligt for os at forstå lokalisering af et nyt protein, POLAR 6, under spredning etape af stomatal-afstamningsceller i the Arabidopsis cotyledon epidermis, når det udtrykkes i celler forud asymmetriske division events og flytter til en karakteristisk område af cellen cortex kort før opdeling finder sted. Billeder kan registreres og strømlinet video nemt produceret ved hjælp af public domain software til at visualisere dynamisk protein lokalisering og celletyper, som de ændrer sig over tid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne time-lapse konfokal teknik tillader longitudinelle studier af fluorescens mærket protein udtryk og lokalisering i individuelle celler i Arabidopsis cotyledon epidermis, som i tilfælde af Polar og andre dynamisk skiftende proteiner er afgørende for en korrekt forståelse af deres funktion. Tidligere har forlænget tid bortfalder billeddannelse blevet anvendt til at undersøge Arabidopsis root svampeinfektion 11 og meristem vækst 5,12, men tilsætning af cotyledon epidermi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Amanda Rychel for bistand til at udvikle tidsforskydningen protokollen og Lynn Pillitteri til konstruktion POLAR :: POLAR-eGFP. Vi er også taknemmelige for ABRC til at forsyne pm-rb-konstruktion. Denne protokol blev udviklet gennem en støttegruppe fra PRESTO pris fra Japan Videnskab, Teknologi og agenturet. Forskning i POLAR blev også støttet af University of Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) og National Science Foundation (MCB-0.855.659). KMP er en NSF Graduate Research Fellow (DGE-0.718.124), og KUT er en HHMI-GBMF investigator.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64 (1983).
- Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A., Bate, M., Martinez Arias, A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. , (1993).
- Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development. Current Biology. 5, 1449 (1995).
- Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. . Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).
- Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).
- Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. &. #. 2. 2. 5. ;. n. c. h. e. z., Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).
- Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development. Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).
- Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).
- Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem. Plant Journal. 48, 619 (2006).
