Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em> Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında> Epidermis
Summary
Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.
Abstract
Gelişimsel bir sıra boyunca hücresel davranışı in vivo dinamiği Görüntüleme doku desenlendirme mekaniğini anlamak için güçlü bir teknik olabilir. Hayvan gelişimi sırasında, anahtar hücre çoğalması ve desenlendirme olaylar çok hızlı bir şekilde ortaya çıkar. Örneğin, Caenorhabditis elegans larva vücut planı için gerekli tüm hücre bölünmeleri yedi mitotik çevrimleri 1, döllenmeden sonra altı saat içinde tamamlanır; Drosophila embriyo on altı veya daha fazla mitoz az 24 saat 2 görülür. Buna karşılık, bitkisel gelişimi sırasında hücre bölünmesi, genellikle günde bir 3,4,5 düzeni üzerinde, yavaştır. Bu eşsiz bir meydan okuma ve hücre bölünmesi ve bitki organogenez sırasında farklılaşma olayları dinamik davranışları belgelemek için uzun vadeli canlı görüntüleme için bir ihtiyaç yüklemektedir. Arabidopsis Epidermis araştıran sinyalizasyon, hücre kaderinin ve bitkilerin gelişim için mükemmel bir model sistemi. Kotiledon, bu doku oluşur hava ve eşit dağıtılmış stoma serpiştirilmiş suya dayanıklı kaplama hücreleri, vanalar açılır ve gaz değişimi ve su kaybı kontrol yakındır. Bu stoma Uygun aralık kendi işlevi için önemlidir ve onların gelişimi asimetrik bölünme ve organize epidermis (Şekil 1) üretmek için hücre farklılaşması bir dizi adımı izler.
Bu protokol, gelişme birkaç gün boyunca hücreleri ve epidermis içinde proteinlerin gözlem izin verir. Bu zaman çerçevesi kök hücre bölünmeleri ve stoma ve epidermal kaldırım hücreleri de dahil olmak üzere epidermal hücrelerin farklılaşma hassas belgelere sağlar. Floresan proteinleri hücre bölünmesini ve farklılaşmasını işlemleri sırasında dinamik değerlendirmek için ilgi çekici proteinler oluşturacak şekilde eklenebilir. Bu teknik, th stomatal-soy hücrelerinin proliferasyonu aşaması sırasında, bize yeni bir protein, POLAR 6 lokalizasyonu anlamak olanak tanırasimetrik bölünme olayları ve bölünmesi meydana kısa bir süre önce hücre korteksin karakteristik bir alana hamle önceki hücrelerde ifade edilir e Arabidopsis kotiledon epidermis. Görüntüleri kayıt ve akıcı görüntü kolaylıkla zamanla değişebilir gibi dinamik protein lokalizasyonu ve hücre tipleri görselleştirmek için kamuya açık yazılımı kullanılarak üretilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu hızlandırılmış konfokal teknik fluoresan etiketli protein ekspresyonu Kutup ve başka dinamik olarak değişen bir protein halinde kendi işlevini uygun bir anlaşılması için önemli olan Arabidopsis kotiledon epidermis, bireysel hücrelerin içinde lokalizasyon uzunlamasına çalışmalar izin verir. Önceden, sürekli zaman atlamalı görüntüleme Arabidopsis kök mantar enfeksiyonu 11 ve meristem büyüme 5,12 incelemek için kullanılan, ancak kotiledon epidermisin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz POLAR :: POLAR-eGFP oluşturmak için zaman atlamalı protokolü ve Lynn Pillitteri geliştirmede yardım için Amanda Rychel ederim. Biz de am-rb inşa sağlamak için ABRC minnettarız. Bu protokol, Japonya Bilim Teknoloji ve Kurumu'ndan PRESTO ödülü bir destek ile geliştirilmiştir. POLAR Araştırma ayrıca, Washington Royalty Araştırma Fonu (RRF-4098) ve Ulusal Bilim Vakfı (MCB-0855659) Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. KMP bir NSF Lisansüstü Araştırma Görevlisi (DGE-0718124) ve KUT bir HHMI-GBMF dedektif.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64 (1983).
- Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A., Bate, M., Martinez Arias, A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. , (1993).
- Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development. Current Biology. 5, 1449 (1995).
- Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. . Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).
- Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).
- Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. &. #. 2. 2. 5. ;. n. c. h. e. z., Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).
- Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development. Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).
- Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).
- Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem. Plant Journal. 48, 619 (2006).
