の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em>シロイヌナズナ子葉</em発芽過程>表皮
Summary
我々は、気孔の分化を文書化、開発の数日間にわたって表皮の共焦点イメージングのための植物の子葉を固定化するためにチャンバースライドやメディアを使用してプロトコルを記述します。フルオロフォアタグ付きタンパク質は、細胞分裂や細胞型分化の過程でそれらの可能な役割の理解を深め、表現と細胞内局在によって動的に追跡することができます。
Abstract
発達シーケンス全体細胞挙動の in vivo動態のイメージングは組織パターン形成のメカニズムを理解するための強力なテクニックです。動物の発生時には、鍵の細胞増殖とパターニングのイベントは非常に迅速に行われます。例えば、幼虫の体の計画に必要な線虫（Caenorhabditis elegans）のすべての細胞分裂が7分裂サイクル1で、受精後6時間以内に完了され、 ショウジョウバエの胚発生の16以上の有糸分裂は、24時間2未満で発生します。これとは対照的に、植物の開発時に細胞分裂は、通常、3,4,5日のオーダーで、遅いです。これはユニークな挑戦と植物器官形成時の細胞分裂と分化のイベントの動的挙動を文書化するための長期的ライブイメージングの必要性を課している。 シロイヌナズナ表皮が植物にシグナリング、細胞の運命、そして開発を調査するための優れたモデル系である。子葉では、この組織は、空気と均等に分散気孔が点在して耐水性舗装細胞、開いたり閉じたり、ガス交換と水の損失を制御することをバルブで構成されています。これらの気孔の適切な間隔は、それらの機能に重要であり、その開発は、非対称分裂と組織表皮（ 図1）を生成する細胞分化段階の順序に従います。
このプロトコルは、開発の数日間にわたって表皮内の細胞やタンパク質の観察を可能にします。この時間枠は、幹細胞の分裂と気孔と表皮舗装細胞を含む表皮細胞の分化の正確なドキュメンテーションを可能にします。蛍光タンパク質は細胞分裂と分化の過程で、そのダイナミクスを評価するために、目的のタンパク質に融合させることができる。この手法は、番目の気孔系統細胞の増殖段階で、私たちは新規タンパク質、POLAR 6の局在を理解することができますそれが細胞内で発現されている電子シロイヌナズナ子葉表皮は、除算が発生する直前に細胞表層の特性領域に非対称分裂のイベントや動きを先行。画像が登録され、合理化されたビデオは簡単に彼らが時間の経過とともに変化するような動的なタンパク質の局在および細胞型を可視化するために、パブリックドメインソフトウェアを用いて製造することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このタイムラプス共焦点技術は極性および他の動的に変化するタンパク質の場合には、それらの機能を適切に理解するために重要であるシロイヌナズナの子葉の表皮の個々の細胞の蛍光標識タンパク質の発現と局在の縦断的研究を可能にします。以前は、持続時間タイムラプスイメージングはシロイヌナズナの根真菌感染症11、分裂組織の成長5,12を調べるために…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、POLAR :: POLAR-EGFP構築するための時間経過プロトコルとリンPillitteriの開発を支援するためのアマンダRychelに感謝します。また、PM-rbが構築提供するためABRCに感謝しています。このプロトコルは、日本科学技術振興機構からさきがけ賞の支援により開発されました。 POLARの研究はまた、ワシントンロイヤリティ研究基金（RRF-4098）、国立科学財団（MCB-0855659）の大学によってサポートされていました。 KMPは、NSF大学院リサーチフェロー（DGE-0718124）であり、本学では、ハワードヒューズ-GBMFの研究者でもある。
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
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