À long terme, à haute résolution d'imagerie confocal Time Lapse d'<em> Cotylédon Arabidopsis</emEpiderme> cours de germination
Summary
Nous décrivons un protocole utilisant des lames de chambre et des médias pour immobiliser cotylédons des plantes pour l'imagerie confocale de l'épiderme pendant plusieurs jours de développement, la documentation différenciation des stomates. Protéines fluorophore-marqués peuvent être suivis de manière dynamique par l'expression et la localisation subcellulaire, accroître la compréhension de leurs rôles possibles lors de la division cellulaire et la différenciation de type.
Abstract
Imagerie in vivo de la dynamique du comportement cellulaire dans une séquence de développement peut être un outil puissant pour comprendre les mécanismes de structuration des tissus. Au cours du développement animal, la prolifération cellulaire et les événements clés de structuration se produire très rapidement. Par exemple, dans Caenorhabditis elegans toutes les divisions cellulaires nécessaires au plan de corps de la larve sont terminés dans les six heures après la fécondation, avec sept cycles mitotiques 1; les mitoses seize ou plus de l'embryogenèse chez la drosophile se produire en moins de 24 heures 2. En revanche, les divisions cellulaires au cours du développement des plantes est lente, typiquement de l'ordre d'une journée 3,4,5. Cela impose un défi unique et un besoin à long terme imagerie en temps réel pour documenter les comportements dynamiques de la division cellulaire et la différenciation des événements pendant l'organogenèse végétale. Épiderme Arabidopsis est un excellent modèle pour la signalisation de l'enquête, le devenir cellulaire et le développement des plantes. Dans le cotylédon, ce tissu est constitué de cellules d'air et résistant à l'eau des chaussées entrecoupés de stomates uniformément répartie, soupapes qui s'ouvrent et se ferment pour contrôler les échanges gazeux et la perte d'eau. Un espacement correct de ces stomates est essentielle à leur fonction et leur développement suit une séquence de division asymétrique et les étapes de différenciation des cellules pour produire de l'épiderme organisé (Fig. 1).
Ce protocole permet l'observation des cellules et des protéines de l'épiderme pendant plusieurs jours de développement. Ce laps de temps permet une documentation précise des cellules souches divisions et la différenciation des cellules épidermiques, y compris les stomates et des cellules épidermiques de la chaussée. Protéines fluorescentes peuvent être fusionnés à des protéines d'intérêt pour évaluer leur dynamique au cours de la division cellulaire et les processus de différenciation. Cette technique nous permet de comprendre la localisation d'une protéine nouvelle, POLAR 6, pendant la phase de prolifération des cellules de la lignée des stomates en eépiderme cotylédon e Arabidopsis, où il est exprimé dans les cellules précédant les événements de la division asymétrique et se déplace vers une zone caractéristique du cortex cellulaire se produit peu de temps avant la division. Les images peuvent être enregistrées et vidéo simplifié facilement produit en utilisant un logiciel du domaine public de visualiser la localisation des protéines dynamique et types cellulaires comme ils changent au fil du temps.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette technique time-lapse confocale permet des études longitudinales sur l'expression des protéines marquées par fluorescence et la localisation dans des cellules individuelles de l'épiderme cotylédon Arabidopsis, qui dans le cas de la polaire et d'autres protéines changent dynamiquement est essentielle à une bonne compréhension de leur fonction. Auparavant, soutenue laps de temps d'imagerie a été utilisée pour examiner l'infection fongique racine d'Arabidopsis …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Amanda Rychel pour l'assistance à l'élaboration du protocole laps de temps et Lynn Pillitteri pour construire POLAR POLAR ::-eGFP. Nous sommes également reconnaissants à ABRC pour fournir le h-rb construire. Ce protocole a été élaboré grâce à un soutien de l'attribution du Japon PRESTO Science Technologie et de l'Agence. La recherche sur POLAR a également été soutenu par l'Université de Washington Banque Research Fund (RRF-4098) et la National Science Foundation (MCB-0855659). KMP est un NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), et KUT est un enquêteur HHMI-GBMF.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
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