Мы описываем протокол, используя камеру слайды и средств массовой информации для иммобилизации завода семядоли для конфокальной микроскопии эпидермиса в течение нескольких дней развития, документирования устьичного дифференциации. Флуорофор-меченных белков можно проследить динамически выражения и внутриклеточной локализации, повышения понимания их возможной роли в процессе деления клеток и их тип дифференциации.
Изображений в динамике естественных клеточных поведение всей последовательности развития может стать мощной техникой для понимания механики ткани рисунка. Во время развития животных, ключевой клеточной пролиферации и структурирование события происходят очень быстро. Например, в Caenorhabditis Элеганс всех клеточных делений, необходимых для личиночной плана тела будут завершены в течение шести часов после оплодотворения, с семи митотических циклов 1; шестнадцать или более митозов эмбриогенеза дрозофилы происходит менее чем за 24 часа 2. В отличие от клеточных делений во время развития растения медленно, как правило, на порядок дня 3,4,5. Это накладывает уникальный вызов и потребность в долгосрочных живого изображения для документирования динамического поведения деления и дифференцировки клеток событий во время завод органогенеза. Arabidopsis эпидермис является отличной системой модель для исследования сигнализации, судьбы клеток и развитие растений. В семядолей, эта ткань состоит из воздуха и воды, устойчивый тротуаров клетки вперемешку с равномерно распределенной устьиц, клапаны, которые открываются и закрываются, чтобы контролировать обмен газов и потери воды. Правильное расстояние между этими устьица имеет решающее значение для их функция, и их развитие следует последовательность асимметричное деление и дифференцировку клеток шаги для создания организованного эпидермиса (рис. 1).
Этот протокол позволяет наблюдать клеток и белков в эпидермисе в течение нескольких дней развития. Этот срок позволяет точной документации стволовых клеточных делений и дифференцировки клеток эпидермиса, в том числе устьиц и эпидермальных клеток тротуар. Флуоресцентные белки могут быть слиты с белками, представляющие интерес для оценки их динамики в процессе клеточного деления и дифференциации процессов. Эта техника позволяет нам понять, локализация нового белка, полярный 6, во время распространения этапе устьичного-линия клеток в гоэлектронной Arabidopsis семядоли эпидермис, где он экспрессируется в клетках предшествующих событий асимметричным разделением и переходит к характерным области клетки коры незадолго до разделения происходит. Изображения могут быть зарегистрированы и упорядочить видео легко производятся с использованием программных средств для визуализации динамической локализации белков и клеточных типов, как они меняются с течением времени.
Это покадровой конфокальной методика позволяет продольных исследований флуоресцентно отмеченных экспрессии белка и локализации в отдельных клетках Arabidopsis эпидермиса семядолей, которые, в случае полярных и других динамично меняющейся белков имеет решающее значение для правиль?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Аманда Rychel за помощь в развитии промежуток времени протокол и Линн Pillitteri для построения POLAR :: POLAR-EGFP. Мы также признательны за предоставление ABRC ч. РБ построить. Этот протокол был разработан в рамках поддержки PRESTO награду от Японии науки, технологий и Агентством. Исследования POLAR была также поддержана Вашингтонского университета роялти исследовательского фонда (RRF-4098) и Национальный научный фонд (MCB-0855659). KMP является NSF Высшее научный сотрудник (DGE-0718124), а кут HHMI-GBMF следователя.
Name of reagent | Company | Catalog Number | Comments |
Bacto Agar | BD | 214010 | |
One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
#5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |