Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em> Arabidopsis Cotyledon</em> Epidermis Bij het ontkiemen
Summary
We beschrijven een protocol met behulp van dia's kamer en de media te planten zaadlobben voor confocale beeldvorming van de opperhuid te immobiliseren over meerdere dagen van de ontwikkeling, het documenteren van stomata differentiatie. Fluorofoor-gemerkte eiwitten kan dynamisch worden gevolgd door expressie en subcellulaire lokalisatie, het verhogen van het inzicht in de mogelijke rollen tijdens de celdeling en cel-type differentiatie.
Abstract
Imaging in vivo dynamiek van cellulair gedrag gedurende een ontwikkelingsvolgorde een krachtige techniek voor het begrijpen van de mechanismen van weefsel patronen zijn. Tijdens de dierlijke ontwikkeling, de belangrijkste celproliferatie en patroonvorming gebeurtenissen zeer snel. Bijvoorbeeld in Caenorhabditis elegans alle celdelingen die voor de larven bouwplan worden binnen zes uur na bevruchting, met zeven mitotische cycli 1, zestien of meer mitosen van Drosophila embryogenese bij minder dan 24 uur 2. Daarentegen celdelingen tijdens plantenontwikkeling traag, typisch in de orde van een dag 3,4,5. Dit legt een unieke uitdaging en een noodzaak voor de lange termijn live beeldvorming voor het documenteren van dynamische gedrag van celdeling en differentiatie gebeurtenissen tijdens fabriek organogenese. Arabidopsis epidermis is een uitstekend modelsysteem voor het onderzoeken van signalering, lot van de cel, en de ontwikkeling van planten. In de zaadlob, dit weefsel bestaat uit lucht-en waterbestendig stoep cellen afgewisseld met gelijkmatig verdeeld huidmondjes, kleppen die open en dicht bij de gasuitwisseling en verlies van water te controleren. Juiste afstand van deze stomata is cruciaal voor de functie en de ontwikkeling volgt een reeks asymmetrische deling en celdifferentiatie stappen om de georganiseerde epidermis (Fig. 1) te produceren.
Dit protocol maakt waarneming van cellen en eiwitten in de epidermis over verschillende dagen van ontwikkeling. Deze termijn maakt een nauwkeurige documentatie van stam-celdelingen en differentiatie van epidermale cellen, met inbegrip van huidmondjes en epidermale stoep cellen. Fluorescerende eiwitten worden gefuseerd om eiwitten van belang hun dynamiek beoordelen tijdens celdeling en differentiatie. Deze techniek staat te begrijpen het lokaliseren van een nieuw eiwit, POLAR 6, tijdens de fase van proliferatie stomatale-lineage cellen in the Arabidopsis cotyledon epidermis, waar het wordt uitgedrukt in cellen voorafgaand asymmetrische deling gebeurtenissen en verplaatst naar een karakteristiek deel van de cel cortex kort voor splitsing optreedt. Afbeeldingen kunnen worden geregistreerd en gestroomlijnd video gemakkelijk geproduceerd met behulp van public domain software om dynamische eiwit lokalisatie en celtypen te visualiseren als ze veranderen in de tijd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze time-lapse confocale techniek maakt longitudinale studies van fluorescent gemerkte eiwit expressie en lokalisatie in afzonderlijke cellen van de epidermis Arabidopsis cotyledon die bij POLAR en dynamisch veranderende eiwitten is essentieel voor een goed begrip van hun functie. Eerder heeft geleidelijk time lapse imaging gebruikt om Arabidopsis wortel schimmelinfectie 11 en meristeem groei 5,12 onderzoeken, maar het toevoegen van de zaadlob epidermis vergroot de veelzijdigheid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Amanda Rychel voor hulp bij de ontwikkeling van de time lapse-protocol en Lynn Pillitteri voor de bouw van POLAR :: POLAR-eGFP. We zijn ook dankbaar ABRC voor het verstrekken van de pm-rb te construeren. Dit protocol is ontwikkeld door middel van een ondersteuning van de PRESTO award uit Japan Wetenschap Technologie en het Agentschap. Onderzoek naar POLAR werd ook ondersteund door de Universiteit van Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) en de National Science Foundation (MCB-0855659). KMP is een NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), en KUT is een HHMI-GBMF onderzoeker.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64 (1983).
- Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A., Bate, M., Martinez Arias, A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. , (1993).
- Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development. Current Biology. 5, 1449 (1995).
- Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. . Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).
- Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).
- Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. &. #. 2. 2. 5. ;. n. c. h. e. z., Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).
- Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development. Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).
- Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).
- Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem. Plant Journal. 48, 619 (2006).
