A largo plazo, de alta resolución de imagen confocal Time Lapse de<em> Cotiledones Arabidopsis</em> Epidermis durante la germinación
Summary
Se describe un protocolo utilizando portaobjetos de cámara y los medios para inmovilizar los cotiledones de la planta para la formación de imágenes confocal de la epidermis durante varios días de desarrollo, la documentación de diferenciación estomática. Proteínas marcadas con fluoróforo se puede seguir dinámicamente por la expresión y localización subcelular, mejorar la comprensión de sus posibles funciones durante la división celular y la diferenciación de células de tipo.
Abstract
Formación de imágenes in vivo de la dinámica en el comportamiento celular a lo largo de una secuencia de desarrollo puede ser una técnica potente para comprender la mecánica de los patrones de tejido. Durante el desarrollo del animal, la proliferación celular y los acontecimientos clave de patrones ocurrir muy rápidamente. Por ejemplo, en Caenorhabditis elegans todas las divisiones celulares requeridos para el cuerpo de la larva se completan dentro de seis horas después de la fertilización, con siete ciclos mitóticos 1; las mitosis dieciséis o más de la embriogénesis de Drosophila se producen en menos de 24 horas 2. En contraste, las divisiones celulares durante el desarrollo de la planta son lentos, típicamente del orden de un día 3,4,5. Esto impone un desafío único y una necesidad a largo plazo de imágenes en directo para documentar los comportamientos dinámicos de la división celular y la diferenciación de los eventos durante la organogénesis vegetal. Epidermis Arabidopsis es un excelente sistema modelo para la señalización de la investigación que el destino celular y el desarrollo de las plantas. En el cotiledón, este tejido se compone de aire y resistentes al agua del pavimento células intercaladas con estomas uniformemente distribuida, válvulas que se abren y cierran para controlar el intercambio de gases y la pérdida de agua. El espaciamiento apropiado de estos estomas es crítica para su función, y su desarrollo sigue una secuencia de división asimétrica y pasos de diferenciación celular para producir la epidermis organizada (Fig. 1).
Este protocolo permite la observación de células y proteínas en la epidermis durante varios días de desarrollo. Este período de tiempo permite una documentación precisa de divisiones de células madre y la diferenciación de las células epidérmicas, incluyendo estomas y células epidérmicas pavimento. Las proteínas fluorescentes se pueden fusionar a proteínas de interés para evaluar su dinámica durante la división celular y los procesos de diferenciación. Esta técnica permite comprender la localización de una nueva proteína, POLAR 6, durante la etapa de proliferación de células de linaje-estomática en thArabidopsis e cotiledón epidermis, donde se expresa en las células anteriores eventos asimétricos de división y se desplaza a una zona característica de la célula de la corteza se produce poco antes de la división. Las imágenes pueden ser registrados y vídeo racionalizado producir fácilmente usando software de dominio público para visualizar la localización de proteínas dinámico y tipos de células a medida que cambian con el tiempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta técnica de lapso de tiempo confocal permite estudios longitudinales de expresión de la proteína marcado fluorescentemente y su localización en células individuales de la epidermis cotiledón Arabidopsis, que en el caso de las proteínas de cambio dinámico polar y otra es fundamental para una comprensión adecuada de su función. Previamente, el tiempo de formación de imágenes sostenida lapso ha sido utilizado para examinar la infección fúngica raíz de Arabidopsis 11 y el crec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Amanda Rychel de asistencia en el desarrollo del protocolo y el lapso de tiempo para la construcción de Pillitteri Lynn POLAR POLAR-eGFP ::. También damos las gracias a ABRC para proporcionar la pm-rb construir. Este protocolo fue desarrollado a través de un soporte de la concesión PRESTO desde Japón Ciencia y Tecnología de la Agencia. La investigación sobre POLAR también fue apoyado por la Universidad de Washington Libre Fondo de Investigación (RRF-4098) y la National Science Foundation (MCB-0855659). KMP es un NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), y KUT es un investigador del HHMI-GBMF.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
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