A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em> Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide> durante la germinazione
Summary
Descriviamo un protocollo mediante diapositive da camera e media per immobilizzare cotiledoni di impianto per l'imaging confocale dell'epidermide più giorni di sviluppo, documentazione differenziazione stomatica. Proteine fluoroforo-tag possono essere monitorati in modo dinamico attraverso l'espressione e la localizzazione subcellulare, aumentare la comprensione dei ruoli possibili durante la divisione cellulare e la differenziazione delle cellule-tipo.
Abstract
Imaging nella dinamica in vivo del comportamento cellulare durante una sequenza di sviluppo può essere una potente tecnica per capire la meccanica del patterning tessuto. Durante lo sviluppo degli animali, la proliferazione cellulare e gli eventi chiave di patterning avvenire molto rapidamente. Per esempio, in Caenorhabditis elegans tutte le divisioni cellulari necessarie per il piano di corpo larvale vengono completate entro sei ore dopo la fecondazione, con sette cicli mitotici 1; le mitosi sedici o più di embriogenesi Drosophila si verificano in meno di 24 ore 2. In contrasto, le divisioni cellulari durante lo sviluppo della pianta sono lenti, tipicamente dell'ordine di un giorno 3,4,5. Questo impone una sfida unica e la necessità di lungo termine di imaging in tempo reale per documentare comportamenti dinamici di divisione cellulare e di eventi di differenziazione durante l'organogenesi pianta. Epidermide Arabidopsis è un sistema eccellente modello per la segnalazione inquirenti, il destino della cellula, e lo sviluppo delle piante. Nel cotiledone, questo tessuto è composto da aria e ad acqua cellule resistenti pavimentazione intervallati da stomi uniformemente distribuito, valvole che si aprono e chiudono per controllare lo scambio di gas e la perdita di acqua. Spaziatura corretta di questi stomi è fondamentale per la loro funzione, e il loro sviluppo segue una sequenza di divisione asimmetrica e gradini di differenziazione cellulare per produrre l'epidermide organizzata (Fig. 1).
Questo protocollo permette l'osservazione di cellule e proteine nell'epidermide più giorni di sviluppo. Questo lasso di tempo permette una precisa documentazione di cellule staminali divisioni e differenziazione delle cellule epidermiche, tra cui stomi e le cellule epidermiche pavimentazione. Proteine fluorescenti possono essere fusi a proteine di interesse per valutare la dinamica durante la divisione cellulare e processi di differenziazione. Questa tecnica permette di comprendere la localizzazione di una nuova proteina, POLAR 6, durante la fase di proliferazione di cellule di lignaggio stomatica-in the cotiledone epidermide Arabidopsis, in cui è espresso in cellule precedenti eventi divisione asimmetrica e si muove a una caratteristica zona della corteccia cella poco prima della divisione si verifica. Le immagini possono essere registrate e video razionalizzato facilmente realizzato utilizzando il software di pubblico dominio per visualizzare la localizzazione dinamica delle proteine e tipi di cellule che cambiano nel corso del tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo time-lapse tecnica confocale per studi longitudinali di espressione della proteina fluorescente tag e localizzazione in singole cellule dell'epidermide cotiledone Arabidopsis, che nel caso delle proteine che cambiano dinamicamente POLARI e gli altri è fondamentale per una corretta comprensione della loro funzione. Precedentemente, sostenuta immagini time lapse è stato utilizzato per esaminare infezione fungina Arabidopsis radice 11 e crescita meristema 5,12, ma …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Amanda Rychel per l'assistenza allo sviluppo del time lapse protocollo e Lynn Pillitteri per la costruzione :: POLAR POLAR-eGFP. Siamo anche grati a ABRC per la prestazione del pm-rb costruire. Questo protocollo è stato sviluppato attraverso un sostegno da parte del PRESTO premio da Giappone Scienza e Tecnologia Agenzia. La ricerca sulle POLAR è stata sostenuta anche dalla University of Washington Libera Research Fund (RRF-4098) e la National Science Foundation (MCB-0855659). KMP è un NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), ed è un KUT HHMI-GBMF investigatore.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
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