Långsiktigt hög upplösning Confocal Time lapse avbildning av<em> Arabidopsis Hjärtblad</em> Epidermis under groning
Summary
Vi beskriver ett protokoll med kammare diabilder och media för att immobilisera växt hjärtblad för konfokal avbildning av epidermis under flera dagar av utveckling, dokumentera stomata differentiering. Fluorofor-märkta proteiner kan spåras dynamiskt genom uttryck och subcellulär lokalisering, öka förståelsen för deras möjliga roller under celldelning och cell-typ differentiering.
Abstract
Imaging in vivo dynamik cellulär beteende under en utvecklings sekvens kan vara en kraftfull teknik för att förstå mekaniken i vävnad mönstring. Under djur utveckling, nyckel cellproliferation och evenemang mönstring sker mycket snabbt. Till exempel i Caenorhabditis elegans alla celldelningar som krävs för larver kroppen planen slutförs inom sex timmar efter befruktningen, med sju mitotiska cykler 1, de sexton eller mer mitoser av Drosophila embryogenes förekommer hos färre än 24 tim 2. Däremot celldelningar under anläggningens utveckling är långsam, typiskt i storleksordningen av en dag 3,4,5. Detta innebär en unik utmaning och behov av långsiktig realtidsundersökningen för att dokumentera dynamiska beteenden celldelning och evenemang differentiering under växt organogenesen. Arabidopsis epidermis är ett utmärkt modellsystem för att utreda signalering, cell öde och utveckling hos växter. I grobladen består denna vävnad av luft-och vatten-resistenta trottoar celler varvat med jämnt fördelad klyvöppningar, ventiler som öppnar och stänger för att kontrollera gasutbyte och vatten förlust. Korrekt avstånd av dessa klyvöppningar är avgörande för deras funktion och deras utveckling följer en sekvens av asymmetrisk delning och celler steg differentiering för att producera den organiserade epidermis (bild 1).
Detta protokoll tillåter observation av celler och proteiner i epidermis under flera dagar av utveckling. Denna tidsram möjliggör exakt dokumentation av stamceller divisioner och differentiering av epidermala celler, inklusive klyvöppningar och epidermalceller trottoar. Fluorescerande proteiner kan fusioneras till proteiner av intresse för att bedöma deras dynamik under celldelning och differentieringsprocesser. Denna teknik gör det möjligt för oss att förstå lokalisering av ett nytt protein, POLAR 6, under spridningen skede av stomatal-härstamning cellerna i the Arabidopsis kotyledon epidermis, där det uttrycks i celler som föregår asymmetriska division händelser och flyttar till en karakteristisk del av cellens cortex strax före division inträffar. Bilder kan registreras och strömlinjeformad video enkelt produceras med allmänt tillgänglig programvara för att visualisera dynamiska protein lokalisering och celltyper som de förändras över tiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna gång-lapse konfokal teknik gör longitudinella studier av fluorescerande taggade proteinuttryck och lokalisering i enskilda celler i Arabidopsis kotyledon epidermis, vilket i fallet med polär och andra dynamiskt föränderliga proteiner är avgörande för en riktig förståelse av deras funktion. Tidigare har ihållande tid lapse avbildning använts för att undersöka Arabidopsis rot svampinfektion 11 och meristem tillväxt 5,12, men lägga till hjärtbladsnod epidermis …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Amanda Rychel för hjälp att utveckla den tid som förflutit protokollet och Lynn Pillitteri för att konstruera POLAR :: POLAR-EGFP. Vi är också tacksamma för ABRC för att tillhandahålla pm-rb konstruktion. Detta protokoll har utvecklats genom ett stöd från PRESTO utmärkelsen från Japan Science Technology och byrån. Forskning om POLAR stöddes också av University of Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) och National Science Foundation (MCB-0.855.659). KMP är ett NSF Graduate Research Fellow (DGE-0.718.124), och KUT är en HHMI-GBMF utredare.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64 (1983).
- Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A., Bate, M., Martinez Arias, A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. , (1993).
- Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development. Current Biology. 5, 1449 (1995).
- Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. . Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).
- Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).
- Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. &. #. 2. 2. 5. ;. n. c. h. e. z., Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).
- Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development. Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).
- Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).
- Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem. Plant Journal. 48, 619 (2006).
