Generation og indvinding af β-celle Sfæroider Fra Step-vækst PEG-peptid hydrogeler
Summary
Den følgende protokol giver teknikker til indkapsling af bugspytkirtlen β-celler i trin-vækst PEG-peptid hydrogeler dannet af thiol-foto-klik reaktioner. Dette materiale platform tilbyder ikke kun en cytocompatible mikromiljø for celleindkapsling, men også tillader brugeren kontrolleret, hurtig genopretning af cellestrukturer dannet inden for hydrogeler.
Abstract
Hydrogeler er hydrofile tværbundne polymerer, som giver et tredimensionelt mikromiljø med vævslignende elasticitet og høj permeabilitet til dyrkning af terapeutisk relevante celler eller væv. Hydrogeler fremstillet ud fra poly (ethylenglycol) (PEG)-derivater anvendes i stigende grad til mange forskellige vævsdyrkningsapplikationer, delvis på grund af deres justerbare og cytocompatible egenskaber. I denne protokol, udnyttede vi thiol-step-vækst photopolymerizations at fabrikere PEG-peptid hydrogeler til indkapsling pancreas MIN6 B-celler. Gelerne blev dannet ved 4-armet PEG-norbornen (PEG4NB) makromeren og en chymotrypsin-følsom peptid tværbinder (CGGYC). Den hydrofile og ikke-fouling karakter af PEG har en cytocompatible mikromiljø for celleoverlevelse og proliferation i 3D, mens anvendelsen af chymotrypsin-sensitive peptidsekvens (C GGY ↓ C, pilen angiver enzym spaltningssted, mens terminal cysteeine rester blev tilføjet til thiol-tværbinding) muliggør hurtig genopretning af cellekonstruktioner danner i hydrogelen. Følgende protokol uddyber teknikker til: (1) Indkapsling af MIN6 β-celler i thiol-hydrogeler, (2) Kvalitativ og kvantitativ cellelevedygtighedsassays at bestemme celleoverlevelse og proliferation, (3) Udvinding af celle sfæroider ved hjælp af chymotrypsin-medieret gel erosion, og (4) Strukturel og funktionel analyse af de inddrevne sfæroider.
Introduction
Hydrogeler er hydrofile tværbundne polymerer med enestående potentiale som stilladser materialer til reparation og regenerering af væv. 1-3 Den høje vandindhold af hydrogeler muliggør let diffusion af oxygen og udveksling af næringsstoffer og metaboliske produkter, som alle er afgørende for opretholdelse af cellelevedygtighed. Desuden er hydrogeler fremragende bærere til reguleret frigivelse og celle produktionstid på grund af deres høje justerbarhed. 2 Syntetiske hydrogeler, såsom dem fremstillet ud fra poly (ethylenglycol) (PEG) anvendes i stigende grad i vævsdyrkningsapplikationer, hovedsagelig på grund af deres cytocompatibility, vævs- såsom elasticitet og høj justerbarhed i materiale fysiske og mekaniske egenskaber. 4-6
Selv om en almindeligt anvendt hydrogel platform, har undersøgelser vist, at PEG-diacrylat (PEGDA) hydrogeler dannet ved kæde-vækst photopolymerizations har en tendens til skade indkapslede celler During netværk tværbinding og in situ celleindkapsling. 7 Den cellulære skader blev i vid udstrækning tilskrives radikalspecies genereret af fotoinitiator molekyler, som udbreder sig gennem vinylgrupper på PEGDA at tværbinde polymerkæder til hydrogeler. Desværre er disse radikalspecies også forårsage spændinger og cellulære beskadigelse under celleindkapsling, især for radikal-følsomme celler, såsom pancreas-β-celler. 8-10 For at opnå en højere maskestørrelse for bedre diffusion og celleoverlevelse, højere molekylvægte PEGDA anvendes ofte til celleindkapsling. Dette vil imidlertid gøre polymerisationskinetik og forårsager suboptimale gel biofysiske egenskaber. 7,11,12 Ud over de ovennævnte ulemper, er det meget vanskeligt at genvinde cellestrukturer fra PEGDA hydrogeler på grund af heterogenitet og ikke-nedbrydelige natur de tværbundne netværk. Medens protease-sensitive peptider kan inkorporeresi PEG makromer backbone at gøre de ellers inerte PEGDA hydrogeler følsomme for enzymatisk spaltning, ofte konjugeringen anvender dyre reagenser, og de resulterende net stadig indeholder høj grad af heterogenitet på grund af karakteren af kæde-vækst polymerisation. 13-15
For nylig er PEG-peptid-hydrogeler dannet via trin-vækst thiol-en fotopolymerisation vist sig at udvise fordelagtige egenskaber til celleindkapsling i hydrogeler dannet ved kæde-vækst fotopolymerisation. 7 De overlegne geleringsegenskaber kinetik thiol-hydrogeler tilskrives 'klik "karakter reaktion mellem thiol og ØNØ funktionaliteter. Sammenlignet med kæde-vækst polymerisation af PEGDA, er thiol-reaktion mindre oxygen inhiberet, hvilket resulterer i hurtigere gelering rate. 16,17 thiol-hydrogeler også højere polymerisation effektivitet og bedre gel biofysiske egenskaber sammenlignet med kæde-vækst PEGDA hydrogeler, 7 , 18 </ Sup>, som resulterer i begrænset cellulær skader forårsaget af radikale arter i fotopolymerisation.
Tidligere thiol-hydrogeler dannet af 4-armet PEG-norbornen (PEG4NB) makromer og bis-cysteinholdige peptid-tværbindere, såsom protease-sensitive peptider er blevet anvendt til celleindkapsling. 7,18 High justerbarhed af PEG-hydrogel-net tilbyder en fleksibel og styrbar 3D mikromiljø til undersøgelse af celleoverlevelse og-aktivitet, mens anvendelsen af protease-sensitive peptidsekvens tilvejebringer en mild måde til genvinding af cellekonstruktioner dannes naturligt i hydrogeler. I denne protokol anvender vi trinvis vækst fotopolymeriserede thiol-hydrogeler fremstillet under anvendelse af 4-armet PEG-norbornen (PEG4NB) og en chymotrypsin-følsom peptid tværbinder (CGGY ↓ C) til indkapsling af MIN6 β-celler. Denne protokol systematisk uddyber teknikker til at studere overlevelse, spredning og klumpformet dannelse af MIN6β-celler i thiol-hydrogeler. Vi tilvejebringer endvidere metode til β-celle sphæroide genopretning og biologisk karakterisering af genvundne sfæroider.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne protokol præsenterer oplysninger om nem indkapsling af celler i thiol-hydrogeler dannet ved trin-vækst fotopolymerisation. Mens et støkiometrisk forhold på 1:1 af norbornen til thiol-funktionelle grupper blev anvendt i denne protokol, kan forholdet justeres afhængigt af eksperimenterne. Foruden en korrekt formulering, er det vigtigt at opretholde homogenitet i præ-polymeropløsningen. Især ved anvendelse forsigtig pipettering at sikre, at cellerne er godt fordelt i den præ-polymeropløsningen for a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev finansieret af NIH (R21EB013717) og IUPUI OVCR (RSFG). Forfatteren takker Ms Han Shih for hendes teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5′-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
