Produksjon og gjenoppretting av β-celle sfæroider Fra Step-vekst PEG-peptid Hydrogeler
Summary
Følgende protokoll gir teknikker for innkapsling bukspyttkjertelen β-celler i trinn-vekst PEG-peptid hydrogeler dannet ved tiol-ENE foto-klikk reaksjoner. Dette materialet plattformen tilbyr ikke bare en cytocompatible mikromiljøet for celle innkapsling, men også tillater brukerstyrt rask gjenoppretting av cellestrukturer dannet innenfor hydrogeler.
Abstract
Hydrogeler er hydrofile tverrbundne polymerer som gir et tredimensjonalt mikromiljø med vev-lignende elastisitet og høy permeabilitet for dyrking terapeutisk relevante celler eller vev. Hydrogeler fremstilt fra poly (etylenglykol) (PEG) derivater blir stadig mer brukt for en rekke tissue engineering applikasjoner, blant annet på grunn av deres tunbare og cytocompatible egenskaper. I denne protokollen, benyttet vi tiol-ene step-vekst photopolymerizations å dikte PEG-peptid hydrogeler for innkapsling bukspyttkjertelen MIN6 b-celler. Gelene ble dannet av 4-arm PEG-norbornen (PEG4NB) makromer og en chymotrypsin-følsom peptid tverrbinder (CGGYC). Den hydrofile og ikke-begroing natur PEG tilbyr cytocompatible mikromiljø for celleoverlevelse og proliferasjon i 3D, mens bruk av kymotrypsin-sensitive peptidsekvens (C GGY ↓ C, indikerer arrow enzymet spaltningssete, mens terminal cysteeine rester ble addert for tiol-en tverrbinding) tillater hurtig gjenoppretting av celle konstruerer dannet innen hydrogel. Følgende protokoll utdyper teknikker for: (1) Innkapsling av MIN6 β-celler i tiol-ene hydrogeler, (2) Kvalitative og kvantitative celleviabilitet analyser for å bestemme celleoverlevelse og proliferasjon, (3) Utvinning av celle sfæroider hjelp kymotrypsin-mediert gel erosjon, og (4) Strukturell og funksjonell analyse av innhentede sfæroider.
Introduction
Hydrogeler er hydrofile tverrbundne polymerer med eksepsjonell potensial som stillas materialer for reparasjon og regenererende vev. 1-3 Det høye vanninnhold hydrogeler tillater enkel diffusjon av oksygen og utveksling av næringsstoffer og cellulære metabolske produkter, som alle er viktige for å opprettholde cellelevedyktighet. I tillegg, hydrogeler er utmerkede bærere for kontrollert frigjøring og celle produksjonstid grunn deres høye tunability. 2 Syntetiske hydrogeler slik som de fremstilt fra poly (etylenglykol) (PEG) blir stadig mer brukt i tissue tekniske anvendelser, hovedsakelig på grunn cytocompatibility deres vev- liker elastisitet og høy tunability i materiale fysiske og mekaniske egenskaper. 4-6
Selv om en vanlig brukt hydrogel plattform, har studier vist at PEG diacrylate (PEGDA) hydrogeler dannet ved kjede-vekst photopolymerizations har en tendens til å skade innkapslede celler during nettverk kryssbinding og in situ celle innkapsling. 7 celleskader ble i stor grad tilskrives radikale arter som genereres av Fotoinitiatoren molekyler, som forplanter seg gjennom vinylgrupper på PEGDA til kryssbindingsfordelingen polymerkjeder inn hydrogeler. Dessverre er disse radikale arter også forårsake spenninger og cellulær skade under celle innkapsling, spesielt for radikal-sensitive celler, såsom bukspyttkjertelen β-celler. 8-10 For å oppnå en høyere maskevidde for bedre diffusjon og celleoverlevelse, høyere molekylvekter PEGDA brukes ofte for celle innkapsling. Dette imidlertid kompromisser polymerisasjons kinetikk og forårsaker suboptimale gel biofysiske egenskaper. 7,11,12 I tillegg til de ovenfor nevnte ulemper, er det svært vanskelig å gjenopprette cellestrukturer fra PEGDA hydrogeler grunnet heterogenitet og ikke nedbrytbart natur de tverrbundede nettverk. Mens protease-sensitive peptider kan inkorporeresinn PEG makromer ryggrad til å gjengi de ellers inerte PEGDA hydrogeler følsomme for enzymatisk spalting, bruker konjugering ofte dyre reagenser og de resulterende nettverk som fremdeles inneholder høy grad av heterogenitet på grunn av beskaffenheten av kjetting-vekst polymerisasjon. 13-15
Nylig har PEG-peptid hydrogeler dannet via step-vekst tiol-ene fotopolymerisasjon vist seg å utvise fortrinnsrett egenskaper for celle innkapsling i hydrogeler dannet av kjede-vekst fotopolymerisasjon. 7 Den overlegne gelering kinetikk tiol-ene hydrogeler er knyttet til "klikk 'natur av reaksjon mellom tiol og ENE funksjonalitet. Sammenlignet med kjede-vekst polymerisasjon av PEGDA er tiol-ene reaksjonen mindre oksygen hemmet som resulterer i raskere gelering rate. 16,17 tiol-ene hydrogeler har også høyere polymerisasjon effektivitet og bedre gel biofysiske egenskaper sammenlignet med kjede-vekst PEGDA hydrogeler, 7 , 18 </ Sup>, som resulterer i begrenset celleskader forårsaket av radikale arter under fotopolymerisasjon.
Tidligere, tiol-ENE hydrogeler dannet av 4-arm PEG-norbornen (PEG4NB) makromer og bis-cysteine inneholdende peptid tverrbindingsmidler, for eksempel protease-sensitive peptider er blitt benyttet for celle innkapsling. 7,18 Høy tunability av PEG hydrogel nettverk tilbyr fleksibel og kontrollerbar 3D mikromiljø for undersøkelse celleoverlevelse og aktivitet, mens bruk av protease-sensitive peptidsekvens gir en mild måte for gjenvinning av celle konstruerer dannet naturlig innenfor hydrogeler. I denne protokollen benytter vi trinn-vekst photopolymerized tiol-ene hydrogeler fremstille bruker 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) og en chymotrypsin-sensitive peptid tverrbinder (CGGY ↓ C) for innkapsling av MIN6 β-celler. Denne protokollen utdyper systematisk teknikker for å studere overlevelse, spredning og spheroid dannelse av MIN6β-celler i tiol-ene hydrogeler. Vi videre gi metode for β-celle spheroid utvinning og biologisk karakterisering av gjenvunne sfæroider.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne protokollen presenterer informasjon om enkel innkapsling av celler i tiol-ene hydrogeler dannet steg-vekst fotopolymerisasjon. Mens en støkiometrisk forhold på 1:1 av norbornen til tiol-funksjonelle grupper ble benyttet i denne protokollen, kan forholdet justeres avhengig forsøkene. I tillegg til en korrekt formulering, er det viktig å opprettholde homogenitet i den pre-polymerløsning. Spesielt bruker skånsom pipettering for å sikre at cellene er godt fordelt i den pre-polymer-løsning for å unngå…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble finansiert av NIH (R21EB013717) og IUPUI OVCR (RSFG). Forfatteren takker Ms Han Shih for henne teknisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5′-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
