استنزاف الحمض النووي الريبي الريباسي لMetagenomic الوتر البعوض RNA-يليها
Summary
وتم وضع بروتوكول نضوب RNA الريباسي (الرنا الريباسي) لتخصيب رسول الحمض النووي الريبي (مرنا) لRNA-يليها من metatranscriptome الأمعاء البعوض. تم إنشاء نموذج الرنا الريباسي تحقيقات محددة، والتي كانت تستخدم لإزالة الرنا الريباسي عبر الطرح، من البعوض والميكروبات الوتر. يمكن أداء بروتوكول يؤدي إلى إزالة ما يقرب من 90-99٪ من الرنا الريباسي.
Abstract
القناة الهضمية البعوض يستوعب المجتمعات الميكروبية الحيوية عبر مراحل مختلفة من دورة حياة الحشرة. وتوصيف الوظائف والقدرات الوراثية للمجتمع الأمعاء توفير نظرة ثاقبة على آثار مجهريات البقعة الأمعاء على الصفات الحياة البعوض. Metagenomic أصبح RNA-تسلسل أداة مهمة لتحليل transcriptomes من الميكروبات المختلفة موجودة في المجتمع الميكروبي. RNA الرسول يتألف عادة٪ فقط 1-3 من الحمض النووي الريبي مجموع، بينما الرنا الريباسي يشكل حوالي 90٪. أنه يمثل تحديا لتخصيب رسول RNA من عينة الحمض النووي الريبي metagenomic الميكروبية لأن معظم الأنواع مرنا بروكاريوتيك تفتقر مستقرة بولي (A) ذيول. هذا يمنع بنسبة ضئيلة د مرنا بوساطة (T) العزلة. هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يستخدم عينة مشتقة الرنا الريباسي التقاط تحقيقات لإزالة الرنا الريباسي من عينة الحمض النووي الريبي مجموع metagenomic. لتبدأ، وتتضخم كل من البعوض والجراثيم الرنا الريباسي الوحيدات شظايا صغيرة وكبيرة من عينة DNA metagenomic المجتمع. ثم، وcommuوقد تم تجميع بيئتهم الخاصة العقاقير المعقدة البيروكسيديز الريباسي تحقيقات RNA T7 في المختبر باستخدام الحمض النووي الريبي بوليميراز. والمهجنة للتحقيقات المعقدة البيروكسيديز الرنا الريباسي الحمض النووي الريبي مجموع ل. يتم التقاط الهجينة من streptavidin المغلفة الخرز وإزالتها من الحمض النووي الريبي مجموع. هذا البروتوكول على أساس الطرح يزيل بكفاءة كل من البعوض والجراثيم الرنا الريباسي من العينة RNA الكلي. تتم معالجة مزيد من العينة المخصب مرنا لتضخيم الحمض النووي الريبي RNA وتسلسل.
Introduction
وقد تقدمت الجيل المقبل من تكنولوجيا التسلسل إلى حد كبير من خلال السماح metagenomics دراسة لتقييم التكوين التصنيفي وظائف الجيني للتجمع الجراثيم. يمكن RNA في رسم التسلسل (RNA-تسلسل) 1 تجاوز الثقافة القائمة على أساليب التحقيق metatranscriptomes الميكروبية في 2-5 سياقات مختلفة. عقبة رئيسية أمام الميكروبية RNA-يليها هو صعوبة في إثراء مرنا، لأنها لا الأنواع مرنا بروكاريوتيك مذيل بعديد الأدينيلات ثابت. ولذلك، بنسبة ضئيلة د رسول بوساطة (T) لا ينطبق تخصيب. إزالة الرنا الريباسي وفيرة، وهو نهج بديل لتخصيب مرنا. وقد استخدمت التجارية مجموعات استنفاد الرنا الريباسي، مثل Microexpress الجرثومي مرنا عدة التخصيب (Ambion)، RiboMinus Transcriptome كيت عزل (بكتيريا) (لايف تكنولوجيز)، ومرنا-ONLY عزل مرنا بروكاريوتيك مجموعة (EPICENTRE) التي تحط تفضيلي الرنا الريباسي مع نوكلياز خارجية، لإزالة الرنا الريباسي 6-8. ومع ذلك، فإن تحقيقات في التقاط Microexpressأو RiboMinus جيدة لإزالة الرنا الريباسي المعروفة من نموذجي الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام (انظر مواصفات الصانعين)، ولكن أقل متوافقة مع الرنا الريباسي من الميكروبات غير معروف. ونتيجة لذلك، قد تكون إزالة أقل كفاءة لمدة 8-10 عينات metagenomic. الى جانب ذلك، كان الإخلاص وفرة مرنا مشكوك عندما تم تطبيق العلاج نوكلياز خارجية 11. وعموما، كان الطرح القائم على استنزاف الرنا الريباسي أقل انحيازا وأكثر فعالية في تخصيب مرنا في إعدادات metagenomic 10-13.
القناة الهضمية البعوض تستوعب المجتمع الميكروبية الحيوية 14. ونحن مهتمون في وصف وظيفة القناة الهضمية microbiome البعوض باستخدام RNA-SEQ. في عينة الحمض النووي الريبي معزولة عن الشجاعة البعوض، سواء RNA البعوض والجراثيم موجودة. هنا، نحن تصف بروتوكول تعديل لاستخدام الرنا الريباسي المجتمع تحقيقات محددة في استنزاف بكفاءة الرنا الريباسي البعوض والجراثيم عن طريق التهجين مطروح. ومرنا الناتجةعينات المخصب المناسبة لRNA-SEQ. ويصور سير العمل الكلي في الشكل 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
A المجتمع الميكروبية المعقدة تكمن في النظام البيئي الأمعاء البعوض 14،16،17. يمكن Metatranscriptomic التسلسل (RNA-يليها) تكشف عن المعلومات الفنية التي تعتمد السياق استجواب من قبل الجراثيم كامل transcriptome 4،18. من الناحية الفنية، بنسبة ضئيلة من د (T) تخصيب بوساطة من بروكاريوت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 1SC2GM092789-01A1، وكان MS باحث هيوز الطبي NMSU هوارد برامج مؤسسة بحوث الجامعية. كان موجها الفيديو والتي تنتجها لاناسا ايمي وبتنسيق من الدكتور فيليب لويس مع معهد الإعلام الإبداعي في NMSU.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
- Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
- Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
- Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
- Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
- Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
- Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
- Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
- Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
- He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
- Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
- Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
- Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
- Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
- Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
- Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
- Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).
