El agotamiento de ARN ribosomal de metagenómica intestino del mosquito RNA-seq
Summary
Un ARN ribosómico (ARNr) de protocolo agotamiento fue desarrollado para enriquecer el ARN mensajero (ARNm) de ARN-ss de la metatranscriptome intestino del mosquito. Sondas de muestreo específicos rRNA, que fueron utilizados para extraer el rRNA mediante sustracción, se crea a partir del mosquito y sus microbios intestinales. Rendimiento del protocolo puede resultar en la eliminación de aproximadamente el 90-99% de rRNA.
Abstract
El intestino del mosquito acomoda las comunidades microbianas dinámicas a través de las diferentes etapas del ciclo de vida del insecto. Caracterización de la capacidad genética y la funcionalidad de la comunidad intestino proporcionará información sobre los efectos de la microbiota intestinal en los hábitos de vida de mosquitos. Metagenómica RNA-Seq se ha convertido en una herramienta importante para analizar transcriptomes de diversos microbios presentes en una comunidad microbiana. El ARN mensajero comprende normalmente sólo el 1-3% del total de ARN, mientras que rRNA constituye aproximadamente el 90%. Es un reto para enriquecer ARN mensajero a partir de una muestra de ARN microbiano metagenomic porque la mayoría de las especies de ARNm procariótico carecen de poli (A) las colas. Esto evita oligo d (T) de aislamiento de mRNA mediada. Aquí se describe un protocolo que emplea muestra derivada rRNA sondas de captura para eliminar el rRNA de una muestra metagenomic ARN total. Para empezar, tanto los mosquitos y microbianos fragmentos de subunidades pequeñas y grandes rRNA se amplificó a partir de ADN de una muestra comunitaria metagenómica. Entonces, la comunidadcomunitarias específicas sondas biotiniladas antisentido ARN ribosomal se sintetizan in vitro usando ARN polimerasa de T7. Las sondas biotiniladas rRNA se hibridan con el ARN total. Los híbridos son capturados por las perlas recubiertas con estreptavidina y se retira del ARN total. Este protocolo sustracción basado elimina eficazmente tanto mosquito y rRNA microbiana del total de la muestra de RNA. La muestra de ARNm enriquecido se procesa adicionalmente para la amplificación del ARN y el ARN Seq-.
Introduction
La próxima generación de la tecnología de secuenciación ha avanzado mucho estudio metagenómica, permitiendo evaluar la composición taxonómica y la funcionalidad de un conjunto genético microbiano. La secuenciación de ARN (RNA-Seq) 1 puede pasar por alto métodos de cultivo para investigar metatranscriptomes microbianos en el 2-5 contextos diferentes. Un obstáculo importante para microbiana RNA-seq es la dificultad en el enriquecimiento de ARNm, como las especies de ARNm procariótico no están establemente poliadenilado. Por lo tanto, oligo d (T) mediada por enriquecimiento mensajero no es aplicable. La eliminación del rRNA abundante es un enfoque alternativo para enriquecer ARNm. Los kits comerciales para el agotamiento de rRNA, como Microexpress kit bacteriana Enriquecimiento ARNm (Ambion), RiboMinus Transcriptome Isolation Kit (bacterias) (Life Technologies), y el ARNm de SÓLO kit de aislamiento de mRNA procariótico (Epicentre) que preferentemente degrada rRNA con una exonucleasa, se han utilizado para retirar rRNA 6-8. Sin embargo, las sondas de captura en Microexpresso RiboMinus son buenos para quitar rRNA conocido desde los típicos bacterias Gram-positivas y Gram-negativas-(ver especificaciones de los fabricantes), pero menos compatible con rRNA de microbios desconocidos. Por consiguiente, la supresión puede ser menos eficiente para las muestras 8-10 metagenómicas. Además, la fidelidad mRNA abundancia era cuestionable cuando el tratamiento se aplicó exonucleasa 11. En general, resta basado agotamiento rRNA fue menos sesgada y más eficaz en el enriquecimiento de mRNA en entornos metagenómicas 10-13.
El intestino del mosquito se adapta a una comunidad microbiana dinámica 14. Estamos interesados en la caracterización de la función del microbioma intestinal mosquito mediante el uso de RNA-Seq. En una muestra de ARN aislado de las entrañas de mosquitos, tanto de ARN de mosquitos y microbianas presentes. Aquí se describe un protocolo modificado para usar sondas específicas de la comunidad rRNA para agotar de manera eficiente rRNA mosquito y microbiana por hibridación sustractiva. El ARNm resultantemuestras enriquecidas son apropiados para RNA-Seq. El flujo de trabajo general se representa en la figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una comunidad microbiana compleja reside en el ecosistema intestinal mosquito 14,16,17. Metatranscriptomic secuenciación (RNA-seq) puede revelar información de contexto funcional dependiente interrogando a todo el transcriptoma 4,18 microbiana. Técnicamente, oligo-d (T) el enriquecimiento de ARNm mediada procariota no es aplicable debido a la ausencia de de poli (A) las colas de los mensajeros. Alternativamente, el agotamiento de rRNA se ha utilizado para el enriquecimiento del ARNm. Aquí, hemo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención 1SC2GM092789-01A1 y MS fue un becario de investigación de NMSU Howard Hughes Medical Research Programs institución universitaria. El video fue dirigido y producido por Amy lanasa y coordinado por el Dr. Philip Lewis con el Creative Media Institute en NMSU.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
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