L'esaurimento delle RNA ribosomiale per metagenomiche Gut Mosquito RNA-seq
Summary
Un RNA ribosomiale (rRNA), il protocollo è stato sviluppato per esaurimento arricchire RNA messaggero (mRNA) per RNA-seq del metatranscriptome intestino zanzara. Sonde rRNA di esempio specifici, che sono stati utilizzati per rimuovere rRNA mediante sottrazione, sono stati creati dalla zanzara e dei suoi microbi intestinali. Prestazioni del protocollo può comportare la rimozione di circa il 90-99% di rRNA.
Abstract
L'intestino zanzara ospita comunità microbiche dinamiche in diverse fasi del ciclo di vita dell'insetto. Caratterizzazione della capacità genetica e la funzionalità della comunità intestino si forniscono informazioni sugli effetti del microbiota intestinale su tratti della vita di zanzara. Metagenomiche RNA-Seq è diventato uno strumento importante per analizzare trascrittomi da vari microbi presenti in una comunità microbica. RNA messaggero costituito normalmente solo 1-3% di RNA totale, mentre rRNA costituisce circa il 90%. E 'difficile per arricchire RNA messaggero da un campione di RNA metagenomica microbica, perché la maggior parte delle specie di mRNA procariote mancano stabili poli (A) code. Questo impedisce oligo d (T) isolamento dell'mRNA mediata. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza campione derivato rRNA catturare sonde per rimuovere rRNA da un metagenomica campione di RNA totale. Per iniziare, sia zanzara e microbiche piccoli e grandi frammenti di rRNA subunità sono amplificati da un campione di DNA metagenomica comunità. Poi, la comunitàcomunitari specifici biotinilati sonde antisenso RNA ribosomiale sono sintetizzati in vitro usando T7 RNA polimerasi. Le sonde biotinilate rRNA sono ibridate l'RNA totale. Gli ibridi sono catturati da streptavidina perle rivestite e rimossi dal RNA totale. Questa sottrazione protocollo basato rimuove efficacemente sia zanzara e rRNA microbica dal campione di RNA totale. Il campione di mRNA arricchito ulteriormente trattato per l'amplificazione di RNA e RNA-Seq.
Introduction
Di prossima generazione di tecnologia di sequenziamento ha notevolmente avanzato studio metagenomica, consentendo di valutare la composizione tassonomica e la funzionalità genetico di un assemblaggio microbica. RNA-Sequencing (RNA-Seq) 1 può ignorare la cultura a base di metodi per indagare metatranscriptomes microbiche in diversi contesti 2-5. Un notevole ostacolo alla microbica RNA-seq è la difficoltà di arricchire mRNA, come le specie di mRNA procariotici non sono stabilmente poliadenilato. Pertanto, oligo d (T) l'arricchimento mediato messenger non è applicabile. La rimozione di rRNA abbondante è un approccio alternativo per arricchire mRNA. Kit commerciali deplezione rRNA, come Microexpress kit batterica Enrichment mRNA (Ambion), RiboMinus Transcriptome Isolation Kit (batteri) (Life Technologies), e mRNA-ONLY Prokaryotic kit di isolamento di mRNA (Epicentre) che degrada preferenzialmente rRNA con una esonucleasi, sono stati utilizzati per la rimozione di rRNA 6-8. Tuttavia, le sonde di cattura in Microexpresso RiboMinus sono buoni per la rimozione di rRNA noto dalle tipiche dei batteri Gram-positivi e Gram-negativi (vedere le specifiche dei costruttori), ma meno compatibile con rRNA da microbi sconosciuti. Conseguentemente, la rimozione può essere meno efficiente per metagenomiche 8-10 campioni. Inoltre, la fedeltà abbondanza mRNA era discutibile quando il trattamento è stato applicato esonucleasi 11. Nel complesso, la sottrazione a base di esaurimento rRNA era meno di parte e più efficace di arricchimento mRNA nelle impostazioni metagenomiche 10-13.
L'intestino zanzara ospita una comunità dinamica microbica 14. Siamo interessati a caratterizzare la funzione del microbioma intestinale zanzara utilizzando RNA-Seq. In un campione di RNA isolato da il coraggio di zanzare, sia RNA zanzara e microbiche sono presenti. Qui, descriviamo un protocollo modificato per utilizzare sonde rRNA specifici della comunità di esaurire in modo efficiente rRNA zanzara e microbica mediante ibridazione sottrattiva. L'mRNA risultantecampioni arricchiti sono adatti per RNA-Seq. Il flusso di lavoro complessivo è rappresentato in figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una comunità microbica complessa risiede nel ecosistema intestinale zanzara 14,16,17. Metatranscriptomic sequenziamento (RNA-seq) può rivelare le informazioni di contesto dipendente funzionale interrogando l'intero trascrittoma microbica 4,18. Tecnicamente, oligo-d (T) di arricchimento mediata mRNA procariotici non è applicabile a causa dell'assenza di stabile poly (A) code dei messaggeri. In alternativa, deplezione rRNA è stato utilizzato per l'arricchimento mRNA. Qui, abbiamo svil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzione 1SC2GM092789-01A1, e MS è stato uno studioso di ricerca di NMSU Howard Hughes Medical Institution di laurea Programmi di Ricerca. Il video è stato diretto e prodotto da Amy Lanasa e coordinato dal Dr. Philip Lewis con il Creative Media Institute NMSU.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
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