Sivrisinek Gut Metagenomic RNA-seq Ribozomal RNA tükenmesi
Summary
A ribozomal RNA (rRNA) azalması protokolü sivrisinek bağırsak metatranscriptome RNA-seq mesajcı RNA (mRNA) zenginleştirmek için geliştirilmiştir. Çıkarma yoluyla rRNA kaldırmak için kullanılan örnek belirli rRNA probları, sivrisinek ve onun bağırsak mikropları oluşturulmuş. Protokol performans rRNA yaklaşık olarak% 90-99 arasında kaldırma neden olabilir.
Abstract
Sivrisinek gut böceğin yaşam döngüsünün farklı aşamaları boyunca dinamik mikrobiyal topluluklar barındırmaktadır. Gut toplumun genetik kapasite ve işlevselliğe Karakterizasyonu sivrisinek hayatı özellikleri üzerine gut mikrobiyotasına etkileri içgörü sağlayacaktır. Metagenomic RNA-Seq bir mikrobiyal topluluk bulunan çeşitli mikroplardan transcriptomes analiz için önemli bir araç haline gelmiştir. RRNA yaklaşık% 90'ını oluşturmaktadır ise mesajcı RNA genellikle total RNA sadece% 1-3 oluşmaktadır. Çoğu prokaryotik mRNA türleri istikrarlı poli (A) kuyrukları eksikliği nedeniyle bir Metagenomic mikrobiyal RNA örnek mesajcı RNA zenginleştirmek için zordur. Bu oligo d (T) aracılı mRNA izolasyon önler. Burada, rRNA bir Metagenomic toplam RNA örnek rRNA kaldırmak için problar yakalamak türetilmiş örnek kullanan bir protokol açıklar. Başlamak için, sivrisinek ve mikrobiyal küçük ve büyük alt ünite rRNA parçaları hem Metagenomic topluluk DNA örneğinden güçlendirilir. Daha sonra, CommuSon veriler özel biyotinli antisense RNA probları T7 RNA polimerazı kullanılarak in vitro olarak sentezlenir. Biotinlenmiş rRNA probları toplam RNA melezi. Melez streptavidin kaplı boncuklar tarafından yakalanır ve toplam RNA kaldırılır. Bu çıkarma tabanlı protokol verimli total RNA örnek sivrisinek ve mikrobiyal rRNA hem kaldırır. MRNA, zenginleştirilmiş bir numune, RNA amplifikasyonu ve RNA-Seq için işleme tabi tutulur.
Introduction
Gelecek nesil dizileme teknolojisi büyük ölçüde taksonomik kompozisyonu ve mikrobiyal topluluk genetik işlevselliğini değerlendirmek için izin vererek metagenomik çalışmada ilerlemiştir. RNA-Dizileme (RNA-Seq) 1 farklı bağlamlarda 2-5 mikrobiyal metatranscriptomes araştırmak için kültüre dayalı yöntemler atlayabilir. Prokaryotik mRNA türleri stabil polyadenylated değil gibi mikrobik RNA-seq için büyük bir engel, mRNA zenginleştirici güçlüktür. Bu nedenle, oligo d (T) aracılı messenger zenginleşme geçerli değildir. Bol rRNA kaldırılmasını mRNA zenginleştirmek için alternatif bir yaklaşımdır. Böyle Microexpress Bakteriyel mRNA Zenginleştirme kiti (Ambion), RiboMinus transcriptome İzolasyon Kiti (Bakteri) (Life Technologies), ve tercihen bir eksonükleaz ile rRNA alçaltır mRNA-SADECE Prokaryotik mRNA İzolasyon kiti (Epicentre) gibi Ticari rRNA tükenmesi kitleri, kullanılmış rRNA 6-8 kaldırmak için. Microexpress Ancak, yakalama problarıya RiboMinus (imalatçılarının şartnamelerine bakın) tipik Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteriler bilinen rRNA kaldırılması için iyi, ama bilinmeyen mikroplardan rRNA ile daha az uyumludur. Sonuç olarak, kaldırma Metagenomic örnekler 8-10 için daha az etkili olabilir. Ekzonükleaz tedavi 11 verildiğinde yanı sıra, mRNA bolluk aslına uygunluk sorgulanabilir. Genel olarak, çıkarma tabanlı rRNA tükenmesi az önyargılı ve Metagenomic ayarları 10-13 mRNA zenginleştirme daha etkili olmuştur.
Sivrisinek gut dinamik mikrobiyal topluluk 14 barındırmaktadır. Biz RNA-Seq kullanarak sivrisinek bağırsak mikrobiyomları fonksiyonunu karakterize ilgilendi. Sivrisinek bağırsaklar izole edilen bir RNA örnek olarak, her ikisi de mikrobiyal sivrisinek ve RNA bulunmaktadır. Burada, biz verimli eksiltici hibridizasyon ile sivrisinek ve mikrobiyal rRNA tüketmek topluluk belirli rRNA probları kullanmak üzere değiştirilmiş bir protokol açıklar. Elde edilen mRNAzenginleştirilmiş örnekleri RNA-Seq için uygundur. Genel akışı Şekil 1 'de tasvir edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Karmaşık bir mikrobiyal topluluk sivrisinek bağırsak ekosistemi 14,16,17 bulunur. Metatranscriptomic sıralama (RNA-seq) tüm mikrobiyal transcriptome 4,18 sorgulayarak bağlam bağımlı işlevsel bilgileri açığa çıkartabilir. Teknik olarak, prokaryotik mRNA oligo-d (T) aracılı zenginleştirme dolayı stabil poli haberciler (A) kuyrukları olmaması için geçerli değildir. Alternatif olarak, rRNA mRNA zenginleştirme tabakasının incelmesi için kullanılmıştır. Burada, sivrisinek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe 1SC2GM092789-01A1 tarafından desteklenen, ve MS NMSU Howard Hughes Tıp Enstitüsü Lisans Araştırma Programları bir araştırma bilim adamı oldu. Video yönetmen ve yapımcı Amy Lanasa tarafından NMSU de Creative Media Enstitüsü ile Dr Philip Lewis tarafından koordine edilmiştir.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
- Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
- Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
- Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
- Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
- Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
- Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
- Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
- Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
- He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
- Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
- Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
- Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
- Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
- Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
- Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
- Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).
