L'appauvrissement de l'ARN ribosomique pour métagénomique Gut Mosquito ARN-seq
Summary
Un protocole d'ARN ribosomal épuisement (ARNr) a été développé afin d'enrichir l'ARN messager (ARNm) pour l'ARN-seq de la metatranscriptome intestin du moustique. Les sondes de prélèvement ARNr spécifiques, qui ont été utilisés pour retirer l'ARNr par soustraction, ont été créés à partir du moustique et ses microbes intestinaux. Performances du protocole peut entraîner la suppression d'environ 90-99% de l'ARNr.
Abstract
L'intestin du moustique, accueille les communautés microbiennes dynamiques à travers les différentes étapes du cycle de vie de l'insecte. Caractérisation de la capacité génétique et la fonctionnalité de la communauté intestin permettra de mieux comprendre les effets du microbiote intestinal sur les traits de vie des moustiques. Métagénomique RNA-Seq est devenu un outil important pour analyser les transcriptomes de divers microbes présents dans une communauté microbienne. L'ARN messager comprend généralement que 1-3% de l'ARN total, tandis que ARNr constitue environ 90%. Il est difficile pour enrichir l'ARN messager à partir d'un échantillon d'ARN microbienne métagénomique, car la plupart des espèces d'ARNm procaryotes n'ont pas stables poly (A) des queues. Cela empêche oligo d (T) isolement d'ARNm médiée. Ici, nous décrivons un protocole qui emploie échantillon dérivé ARNr des sondes de capture pour enlever ARNr partir d'un échantillon d'ARN total de métagénomique. Pour commencer, à la fois contre les moustiques et microbiennes petits et grands fragments d'ARNr sous-unités sont amplifiés à partir d'un échantillon d'ADN métagénomique communauté. Ensuite, la communautécommunautaires spécifiques biotinylés antisens ribosomique sondes d'ARN sont synthétisés in vitro en utilisant l'ARN polymérase T7. Les sondes biotinylées ARNr sont hybridées à l'ARN total. Les hybrides sont capturés par des billes revêtues de streptavidine et retiré de l'ARN total. Ce protocole basé sur la soustraction élimine efficacement à la fois contre les moustiques et l'ARNr microbienne de l'échantillon d'ARN total. L'échantillon enrichi en ARNm est ensuite traité pour l'amplification de l'ARN et ARN-Seq.
Introduction
La technologie de séquençage de nouvelle génération a beaucoup progressé étude métagénomique en permettant d'évaluer la composition taxonomique et génétique d'une fonctionnalité associations microbiennes. Séquençage d'ARN (RNA-Seq) 1 peut contourner culture à base de méthodes pour étudier metatranscriptomes microbiennes dans 2-5 contextes différents. Un obstacle majeur à microbien ARN-seq est la difficulté à enrichir l'ARNm, comme les espèces d'ARNm procaryotes ne sont pas stable polyadénylé. Par conséquent, oligo d (T) l'enrichissement messager médiation n'est pas applicable. Suppression de l'ARNr abondante est une approche alternative pour enrichir l'ARNm. Trousses commerciales d'épuisement ARNr, comme Microexpress kit ARNm enrichissement bactérien (Ambion), RiboMinus Isolation Kit transcriptome (bactéries) (Life Technologies), et l'ARNm UNIQUEMENT kit d'isolation d'ARNm procaryote (Epicentre) qui dégrade préférentiellement ARNr avec une exonucléase, ont été utilisés de suppression de l'ARNr 6-8. Cependant, les sondes de capture dans Microexpressou RiboMinus sont bons pour enlever ARNr connu de types de bactéries Gram-positives et Gram-négatives (voir les spécifications du fabricant), mais moins compatible avec les ARNr des microbes inconnus. Par conséquent, la suppression peut être moins efficace pour les 8-10 des échantillons métagénomique. Par ailleurs, la fidélité abondance de l'ARNm était discutable lorsque le traitement a été appliqué exonucléase 11. Dans l'ensemble, la soustraction basée sur l'appauvrissement de l'ARNr est moins biaisé et plus efficace dans l'enrichissement d'ARNm dans les paramètres métagénomiques 10-13.
L'intestin du moustique, accueille une communauté microbienne dynamique 14. Nous cherchons à caractériser la fonction du microbiome intestin du moustique en utilisant l'ARN-Seq. Dans un échantillon d'ARN isolés à partir des entrailles de moustiques, les deux ARN moustiques et des microbes sont présents. Ici, nous décrivons un protocole modifié d'utiliser des sondes ARNr communautaires spécifiques pour épuiser les ARNr efficacement les moustiques et microbienne par hybridation soustractive. L'ARNm résultantéchantillons enrichis sont appropriés pour l'ARN-Seq. Le flux global est représenté dans la figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une communauté microbienne complexe réside dans l'écosystème intestin du moustique, 14,16,17. Metatranscriptomic séquençage (ARN-seq) peut révéler des informations de contexte dépend fonctionnelle en interrogeant la totalité du transcriptome 4,18 microbienne. Techniquement, oligo-d (T) d'enrichissement de l'ARNm procaryote médiation n'est pas applicable en raison de l'absence de stabilité poly (A) queues des messagers. Alternativement, l'appauvrissement de l'…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le NIH subvention 1SC2GM092789-01A1, et MS était un érudit de la recherche NMSU Howard Hughes Programmes Établissement de recherches médicales de premier cycle. La vidéo a été réalisé et produit par Amy Lanasa et coordonné par le Dr Philip Lewis avec le Creative Media Institute à NMSU.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
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