דלדול של רנ"א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq
Summary
פרוטוקול ריבוזומלי רנ"א (rRNA) דלדול פותח כדי להעשיר RNA שליח (mRNA) לRNA-seq של metatranscriptome בטן היתוש. בדיקות דגימה ספציפיות rRNA, ששמשו להסרת rRNA דרך חיסור, נוצרו מהיתושים וחיידקי המעיים שלה. ביצועים של הפרוטוקול יכולים להוביל להסרה של כ 90-99% מrRNA.
Abstract
בטן היתוש להכיל קהילות מיקרוביאלי דינמיות על פני שלבים שונים של מחזור החיים של החרק. אפיון של היכולות ותפקודים הגנטיים של קהילת המעיים יספק תובנה לתוך ההשפעות של חיידקי מעיים על תכונות חי יתושים. Metagenomic RNA-Seq הפך כלי חשוב לנתח transcriptomes מחיידקים המצויים בקהילת חיידקים שונים. RNA השליח בדרך כלל מהווה רק 1-3% מכלל רנ"א, בעוד rRNA מהווה כ 90%. זה מאתגר להעשרת RNA שליח ממדגם רנ"א מיקרוביאלי metagenomic כי מיני mRNA פרוקריוטים רוב חסרים (A) זנבות פולי יציבים. זה מונע בידוד Oligo ד (ט) בתיווך-mRNA. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שמעסיק מדגם נגזר rRNA ללכוד בדיקות כדי להסיר rRNA ממדגם RNA סך metagenomic. כדי להתחיל, גם יתושים וברי rRNA של חיידקים קטנים וגדולים למקטע הם מוגברים מדגימת DNA קהילת metagenomic. ואז, commuבדיקות nity ספציפיות biotinylated antisense RNA ריבוזומלי מסונתזות במבחנה באמצעות RNA פולימראז T7. בדיקות rRNA biotinylated הם הכלאה לרנ"א בסך הכל. הכלאיים נתפסו על ידי חרוזי streptavidin מצופים והוצאו מכלל רנ"א. פרוטוקול חיסור מבוסס ביעילות מסיר גם יתושים וrRNA של חיידקים מדגימת RNA המוחלטת. המדגם המועשר mRNA עובר עיבוד נוסף להגברת RNA ו-RNA-Seq.
Introduction
טכנולוגיית הדור הבא של רצף התקדמה מחקר metagenomics מאוד על ידי המאפשר להעריך את ההרכב הטקסונומי והפונקציונלי גנטיים של מכלול של חיידקים. RNA-רצף (RNA-Seq) 1 יכול לעקוף שיטות תרבות מבוססת לחקור metatranscriptomes מיקרוביאלי ב2-5 הקשרים שונים. מכשול עיקרי לחיידקי RNA-seq הוא הקושי בהעשרה-mRNA, כמין mRNA פרוקריוטים אינו polyadenylated ביציבות. לכן, העשרת Oligo ד (ט) בתיווך שליח אינה ישימה. הסרת rRNA שפע היא גישה חלופית להעשרה-mRNA. ערכות מסחריות rRNA דלדול, כגון ערכת Microexpress קטריאלי mRNA העשרה (Ambion), RiboMinus transcriptome בידוד קיט (חיידקים) (חי טכנולוגיות), ורק mRNA-ערכה פרוקריוטים mRNA בידוד (Epicentre) שמעדיפים מדרדרת rRNA עם exonuclease, היו בשימוש להסרת rRNA 6-8. עם זאת, בדיקות ללכוד בMicroexpressאו RiboMinus טוב להסרת rRNA הידוע מחיידקים גראם חיוביים וגראם שליליים טיפוסיים (ראה מפרטים של יצרנים), אבל פחות מתאים עם rRNA מחיידקים לא ידועים. כתוצאה מכך, ההסרה עשויה להיות פחות יעילה עבור 8-10 דגימות metagenomic. חוץ מזה, נאמנות שפע mRNA הייתה מוטלת בספק, כאשר טיפול exonuclease יושם 11. בסך הכל, דלדול rRNA חיסור מבוסס היה פחות מוטה ויעיל יותר בהעשרת mRNA בהגדרות metagenomic 10-13.
בטן היתוש להכיל חיידקי קהילה דינמית 14. אנו מעוניינים באפיון הפונקציה של microbiome בטן היתוש באמצעות RNA-Seq. במדגם RNA המבודד מאומץ היתושים, שני RNA היתושים וחיידקים הם הווה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול הותאם לשימוש בדיקות rRNA ספציפיות קהילתיות יעילות כדי לרוקן rRNA יתושים וחיידקים על ידי הכלאת חיסור. MRNA כתוצאהדגימות מועשרות מתאימות לRNA-Seq. העבודה הכוללת מתוארת באיור 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
קהילת חיידקים מורכבת מתגוררת במערכת האקולוגית בטן יתוש 14,16,17. Metatranscriptomic רצף (RNA-seq) יכול לחשוף מידע פונקציונלי תלוי בהקשר של חקירה כל חיידקי transcriptome 4,18. מבחינה טכנית, העשרת Oligo-ד (ט) בתיווך של mRNA פרוקריוטי אינה ישימה בשל העדר (A) זנבות של השליחים פולי היציבים. ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH 1SC2GM092789-01A1, והטרשת הנפוצה הייתה תלמיד מחקר של תוכניות NMSU הווארד יוז רפואי מכון מחקר לתואר ראשונות. הסרטון ביים והפיק על ידי איימי Lanasa ומתואם על ידי ד"ר פיליפ לואיס עם מדיה מכון קריאייטיב ב NMSU.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
- Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
- Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
- Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
- Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
- Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
- Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
- Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
- Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
- He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
- Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
- Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
- Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
- Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
- Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
- Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
- Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).
