Isolering og forberedelse af bakteriecellevægge til kompositorisk analyse af ultraperformet væskekromatografi
Summary
Bakteriecellevæggen består af peptidoglycan, et makromolekylært netværk af sukkerstrenge, der krydses af peptider. Ultra Performance Liquid Chromatography giver høj opløsning og gennemløb for nye opdagelser af peptidoglycan sammensætning. Vi præsenterer en procedure for isolering af cellevægge (sacculi) og deres efterfølgende forberedelse til analyse via UPLC.
Abstract
Bakteriecellevæggen er afgørende for bestemmelsen af celleform under vækst og division og opretholder cellernes mekaniske integritet i lyset af turgortryk flere atmosfærer i størrelse. På tværs af de forskellige former og størrelser af bakterieriget, er cellevæggen består af peptidoglycan, et makromolekylært netværk af sukker tråde crosslinked af korte peptider. Peptidoglycans centrale betydning for bakteriel fysiologi ligger til grund for dets anvendelse som et antibiotikummål og har motiveret genetiske, strukturelle og cellebiologiske undersøgelser af, hvordan det er robust samlet under vækst og division. Ikke desto mindre er der stadig behov for omfattende undersøgelser for fuldt ud at karakterisere de vigtigste enzymatiske aktiviteter i peptidoglycansyntese og den kemiske sammensætning af bakteriecellevægge. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) er en kraftfuld analysemetode til kvantificering af forskelle i den kemiske sammensætning af væggene i bakterier dyrket under en række miljømæssige og genetiske forhold, men dens gennemløb er ofte begrænset. Her præsenterer vi en enkel procedure for isolering og forberedelse af bakteriecellevægge til biologiske analyser af peptidoglycan via HPLC og Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), en udvidelse af HPLC, der bruger pumper til at levere ultrahøje tryk på op til 15.000 psi sammenlignet med 6.000 psi til HPLC. I kombination med forberedelsen af bakterielle cellevægge præsenteret her, vil lavvolumenprøveinjektorer, detektorer med høje prøvetagningshastigheder, mindre prøvemængder og kortere køretider for UPLC muliggøre høj opløsning og gennemstrømning for nye opdagelser af peptidoglycan sammensætning og grundlæggende bakteriecellebiologi i de fleste biologiske laboratorier med adgang til en ultracentrifuge og UPLC.
Introduction
Målet med den metode, der er beskrevet heri, er at isolere intakte bakteriecellevægge (sacculi) og fordøje peptidoglycan (PG), således at Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) kan bruges til at give oplysninger såsom identiteten af muropeptidkomponenterne og deres koncentrationer, den gennemsnitlige længde af glykaflestrenge og den brøkdel af materiale, der er involveret i krydsninger mellem tråde. For en detaljeret diskussion af PG biokemi og muropeptide arter er der flere fremragende anmeldelser, der beskriver PG-struktur og dens rolle i infektion, resistens, morfogenese og vækst1-6. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) til PG-analyse blev oprindeligt udviklet af Glauner og Schwarz i 1980’erne og er for nylig blevet forbedret og anvendt i vid udstrækning i laboratorierne i Miguel de Pedro og Waldemar Vollmer. Tidligere metoder udnyttede aminosyreanalyse eller papirkromatografi, tidskrævende og kedelige teknikker, der ikke giver nøjagtige eller fuldstændige vurderinger af cellevægskomponenter.
UPLC-analyse kan nemt implementeres i ethvert grundforskningslaboratorium, der har adgang til en ultracentrifuge og UPLC. Uplc-metoden, som vi præsenterer nedenfor, isolerer komplette sacculi og giver dermed omfattende, kvantitative oplysninger om alle kemiske arter deri. Denne metode giver præcis kvantificering af alle muropeptider på tværs af en population af bakterier, alt sammen inden for en 20 minutters UPLC-kørsel. Gennemførelsen af denne metode involverer kun grundlæggende laboratoriefærdigheder uden betydelige finansielle investeringer i materialer. For at udføre trinene i denne metode behøver forskerne kun at være dygtige til pipetter, forberede buffere og enzymer og justere pH, hvilket gør det tilgængeligt for en lang række videnskabelige discipliner. Valget af enzymer, der anvendes i denne protokol, afhænger af den bakterieart, der analyseres. den her beskrevne protokol er nyttig for Escherichia coliog har generelt vist sig at være tilstrækkelig til at isolere sacculi fra andre Gram-negative organismer. Høring af litteraturen anbefales, når du anvender denne metode på Gram-positive bakterier; i disse arter har sacculus rensning traditionelt været vanskeligere. Især kan denne metode skal ændres med hensyn til enzymvalg og længden af fordøjelsestider for at imødekomme de tykkere vægge og tilbehørspolymerer såsom teikolesyrer af gram-positive bakterier. Det første enzym i denne protokol kløver ydre membran lipoprotein (såsom Braun’s lipoprotein, eller Lpp) vedhæftet fil til peptidoglycan, og dermed frigive alle, men C-terminal di- (eller tri-) peptid af Lpp fra cellevæggen. Dette trin er nødvendigt ved undersøgelse af Enterobacteria, men mange andre Gram-negative bakterier har ingen Lpp-ækvivalenter, og derfor kan dette trin springes over. Et andet enzym kløver specifikt efter den muramiske syrekomponent i peptidoglycanen og opløser den disaccharidunderenhed, der danner muropeptidarten. For at give en nøjagtig vurdering af PG’s arkitektur skal man være omhyggelig med at fordøje sacculi for at forhindre spaltning af krydsbroerne eller nogen anden del af peptidstammen.
Selvom de kemiske sammensætninger af peptidoglycan fra over 100 stammer af ~ 40 bakteriearter er blevet analyseret af HPLC, er der ikke udført analyser med UPLC-teknologi. Derudover har tidligere arbejde karakteriseret peptidoglycan fra kun en lille brøkdel af det bakterielle domæne, delvis begrænset af gennemløbet af HPLC. Derfor vil formidling af denne metode til så mange forskere som muligt og implementering på UPLC-platforme være afgørende for at drive fysiologiske undersøgelser af den store del af bakteriearter, hvis peptidoglycan endnu ikke er kategoriseret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et kritisk skridt i denne procedure er trin 3.1 i den anden dag i prøveforberedelsen. Hvis SDS er udfældet natten over, eller hvis prøverne er blevet opbevaret i 4% SDS i flere uger ved stuetemperatur, skal prøverne koges igen i mindst 1 time for at gensoliere SDS. En almindelig årsag til SDS nedbør er brugen af medier med kaliumsalte, så kalium bør undgås i medierne, hvis det er muligt. Som nævnt i afsnittet Repræsentative resultater er det også afgørende at justere pH-normen inden for det isoelektriske pun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH Director’s New Innovator Award DP2OD006466 (til K.C.H.). Forfatterne takker Russell Monds for en praktisk demonstration af metoden og for videnskabelige diskussioner.
Materials
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler | |||
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. The Composition of the murein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D’Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. . The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
