Isolatie en bereiding van bacteriële celwanden voor compositorische analyse door Ultra Performance Liquid Chromatography
Summary
De bacteriële celwand bestaat uit peptidoglycan, een macromoleculair netwerk van suikerstrengen gekruist door peptiden. Ultra Performance Liquid Chromatography biedt een hoge resolutie en doorvoer voor nieuwe ontdekkingen van peptidoglycan samenstelling. We presenteren een procedure voor de isolatie van celwanden (sacculi) en hun daaropvolgende voorbereiding voor analyse via UPLC.
Abstract
De bacteriële celwand is van cruciaal belang voor de bepaling van de celvorm tijdens groei en deling en behoudt de mechanische integriteit van cellen in het gezicht van turgordrukken verschillende atmosferen in omvang. In de verschillende vormen en maten van het bacterierijk bestaat de celwand uit peptidoglycan, een macromoleculair netwerk van suikerstrengen gekruist door korte peptiden. Peptidoglycan’s centrale belang voor bacteriële fysiologie ligt ten grondslag aan het gebruik ervan als een antibioticumdoel en heeft genetische, structurele en celbiologische studies gemotiveerd over hoe het robuust wordt geassembleerd tijdens groei en deling. Niettemin zijn er nog steeds uitgebreide onderzoeken nodig om de belangrijkste enzymatische activiteiten in peptidoglycansynthese en de chemische samenstelling van bacteriële celwanden volledig te karakteriseren. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is een krachtige analytische methode voor het kwantificeren van verschillen in de chemische samenstelling van de wanden van bacteriën die onder verschillende omgevings- en genetische omstandigheden worden gekweekt, maar de doorvoer ervan is vaak beperkt. Hier presenteren we een eenvoudige procedure voor de isolatie en bereiding van bacteriële celwanden voor biologische analyses van peptidoglycan via HPLC en Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), een uitbreiding van HPLC die pompen gebruikt om ultrahoge drukken tot 15.000 psi te leveren, vergeleken met 6.000 psi voor HPLC. In combinatie met de voorbereiding van hier gepresenteerde bacteriële celwanden, zullen de low-volume monsterinjectoren, detectoren met hoge bemonsteringssnelheden, kleinere monstervolumes en kortere looptijden van UPLC een hoge resolutie en doorvoer mogelijk maken voor nieuwe ontdekkingen van peptidoglycansamenstelling en fundamentele bacteriële celbiologie in de meeste biologische laboratoria met toegang tot een ultracentrifuge en UPLC.
Introduction
Het doel van de hierin beschreven methode is om intacte bacteriële celwanden (sacculi) te isoleren en de peptidoglycan (PG) zodanig te verteren dat Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) kan worden gebruikt om informatie te verstrekken zoals de identiteit van de muropeptidecomponenten en hun concentraties, de gemiddelde lengte van glycanstrengen en de fractie materiaal die betrokken is bij crosslinks tussen strengen. Voor een gedetailleerde bespreking van PG biochemie en muropeptide soorten, zijn er verschillende uitstekende beoordelingen die PG structuur en zijn rol in infectie, resistentie, morfogenese, en groei1-6beschrijven . High Performance Liquid Chromatography (HPLC) voor PG-analyse werd aanvankelijk ontwikkeld door Glauner en Schwarz in de jaren 1980, en meer recentelijk is uitgebreid verbeterd en toegepast in de laboratoria van Miguel de Pedro en Waldemar Vollmer. Eerdere methoden maakten gebruik van aminozuuranalyse of papierchromatografie, tijdrovende en vervelende technieken die geen nauwkeurige of volledige beoordelingen van celwandcomponenten opleveren.
UPLC-analyse kan eenvoudig worden geïmplementeerd in elk fundamenteel onderzoekslaboratorium dat toegang heeft tot een ultracentrifuge en UPLC. De UPLC-methode die we hieronder presenteren, isoleert volledige sacculi en biedt daarmee uitgebreide, kwantitatieve informatie over alle chemische soorten daarin. Deze methode levert nauwkeurige kwantificering van alle muropeptiden over een populatie van bacteriën, allemaal binnen een 20 minuten UPLC run. De toepassing van deze methode omvat alleen basislaboratoriumvaardigheden, zonder aanzienlijke financiële investeringen in materialen. Om de stappen in deze methode uit te voeren, hoeven onderzoekers alleen bekwaam te zijn in pipetten, het voorbereiden van buffers en enzymen en het aanpassen van de pH, waardoor het toegankelijk is voor een breed scala aan wetenschappelijke disciplines. De keuze van enzymen die in dit protocol worden gebruikt, hangt af van de soort bacterie die wordt geanalyseerd; het hier beschreven protocol is nuttig voor Escherichia coli, en is over het algemeen voldoende gebleken voor het isoleren van sacculi van andere Gram-negatieve organismen. Overleg met de literatuur wordt aanbevolen bij het toepassen van deze methode op grampositieve bacteriën; bij deze soorten is sacculuszuivering van oudsher moeilijker. In het bijzonder kan deze methode worden gewijzigd in termen van enzymkeuze en lengte van de spijsverteringstijden om de dikkere wanden en accessoirepolymeren zoals teichoïnezuren van grampositieve bacteriën te huisvesten. Het eerste enzym in dit protocol splijt buitenste membraan lipoproteïne (zoals Braun’s lipoproteïne, of Lpp) gehechtheid aan de peptidoglycan, waardoor alles behalve de C-terminale di- (of tri-) peptide van de Lpp uit de celwand. Deze stap is nodig bij het onderzoeken van Enterobacteriën, maar veel andere Gram-negatieve bacteriën hebben geen Lpp-equivalenten, en daarom kan deze stap worden overgeslagen. Een tweede enzym splijt specifiek na de muramische zuurcomponent van de peptidoglycan, waardoor de disaccharidesubeenheid die de muropeptidesoort vormt, wordt opgelost. Om een nauwkeurige beoordeling van de architectuur van de PG te bieden, moet voorzichtig worden omgegaan met het verteren van de sacculi om decolleté van de dwarsbruggen of een ander deel van de peptidestam te voorkomen.
Hoewel de chemische samenstellingen van peptidoglycan uit meer dan 100 stammen van ~40 bacteriesoorten zijn geanalyseerd door HPLC, zijn er geen analyses uitgevoerd met UPLC-technologie. Bovendien heeft eerder werk peptidoglycan gekenmerkt uit slechts een klein deel van het bacteriële domein, deels beperkt door de doorvoer van HPLC. Daarom zal de verspreiding van deze methode onder zoveel mogelijk onderzoekers en de implementatie op UPLC-platforms van cruciaal belang zijn voor het stimuleren van fysiologische studies van de grote fractie van bacteriële soorten waarvan peptidoglycan nog moet worden gecategoriseerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een cruciale stap in deze procedure is stap 3.1 van de tweede dag van de monstervoorbereiding. Als het SDS ‘s nachts is neergeslagen of als de monsters gedurende enkele weken bij kamertemperatuur in 4% SDS zijn bewaard, moeten de monsters ten minste 1 uur opnieuw worden gekookt om de SDS opnieuw te laten koken. Een veel voorkomende oorzaak voor SDS-neerslag is het gebruik van media met kaliumzouten, dus kalium moet indien mogelijk in media worden vermeden. Zoals vermeld in de sectie Representatieve resultaten, is het ook…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door nih Director’s New Innovator Award DP2OD006466 (naar K.C.H.). De auteurs danken Russell Monds voor een praktische demonstratie van de methode en voor wetenschappelijke discussies.
Materials
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler | |||
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. The Composition of the murein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D’Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. . The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
