超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製
Summary
細菌細胞壁はペプチドによって架橋された糖鎖の高分子ネットワークであるペプチドグリカンで構成される。超高性能液体クロマトグラフィーは、ペプチドグリカン組成物の新しい発見に高解像度とスループットを提供します。細胞壁(sacculi)の分離とUPLCによる分析のためのその後の準備のための手順を提示する。
Abstract
細菌細胞壁は、成長および分裂時の細胞形状の決定に重要であり、大きさの複数の雰囲気のターゴール圧力に直面して細胞の機械的完全性を維持する。細菌の王国の多様な形状と大きさにわたって、細胞壁は、短いペプチドによって架橋された糖鎖の高分子ネットワークであるペプチドグリカンで構成されています。細菌生理学におけるペプチドグリカンの中心的な重要性は、抗生物質標的としての使用の根底にあり、成長と分裂の間にどのように強固に組み立てられるかの遺伝的、構造的、細胞生物学的研究を動機づけている。それにもかかわらず、ペプチドグリカン合成における主要な酵素活性と細菌細胞壁の化学組成を完全に特徴付けるためには、依然として広範な調査が必要である。ハイパフォーマンス液体クロマトグラフィー(HPLC)は、様々な環境・遺伝的条件下で増殖する細菌の壁の化学組成の違いを定量化するための強力な分析方法ですが、そのスループットは、多くの場合、制限されています。ここでは、HPLC用6,000 psiと比較して、ポンプを利用して最大15,000 psiの超高圧を供給するHPLCの拡張であるHPLCおよび超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)を介したペプチドグリカンの生物学的分析のための細菌細胞壁の単離および調製のための簡単な手順を提示します。ここで紹介する細菌細胞壁の調製と組み合わせて、少量のサンプルインジェクター、高いサンプリングレート、より小さいサンプル量、およびUPLCの短い実行時間を備えた検出器は、超遠心分離機およびUPLCへのアクセスを持つほとんどの生物学的実験室でのペプチドグリカン組成物および基本的な細菌細胞生物学の新しい発見のための高解像度およびスループットを可能にする。
Introduction
本明細書に記載されている方法の目的は、無傷の細菌細胞壁(sacculi)を分離し、超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)がムロペプチド成分の同一性とその濃度、グリカン鎖の平均長さ、および鎖間の架橋に関与する材料の割合などの情報を提供するために使用できるようにペプチドグリカン(PG)を消化することです。PG生化学およびムロペプチド種の詳細な議論のために、PG構造および感染、抵抗性、形態形成、および成長におけるその役割を1〜6に記述するいくつかの優れたレビューがある。PG分析のための高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)は、1980年代にグラナーとシュワルツによって最初に開発され、最近ではミゲル・デ・ペドロとワルデマール・ヴォルマーの研究室で広く強化され、適用されています。これまでの方法では、アミノ酸分析またはペーパークロマトグラフィー、細胞壁成分の正確または完全な評価を得ない時間と退屈な技術を使用しました。
UPLC分析は、超遠心分離機やUPLCにアクセスできる基礎研究所で簡単に実装できます。以下に提示するUPLC法は、完全なサキュリを分離し、その中のすべての化学種に関する包括的かつ定量的な情報を提供する。この方法は、20分UPLCラン内のすべての細菌集団にわたってすべてのムロペプチドの正確な定量化をもたらす。この方法の実装は、材料に多額の財政的投資をすることなく、基本的な実験室のスキルのみを含みます。この方法のステップを実行するためには、研究者はピペット処理、バッファーおよび酵素の調製、およびpHの調整に熟練するだけで、幅広い科学的分野にアクセス可能になります。このプロトコルで使用される酵素の選択は、分析される細菌の種に依存します。ここで説明するプロトコルは 、大腸菌に有用であり、一般的に他のグラム陰性生物からサキュリを単離するのに適していることが分かってきた。グラム陽性菌にこの方法を適用する場合は、文献との相談をお勧めします。これらの種では、伝統的に糖分精製がより困難であった。特に、この方法は、グラム陽性菌のテイコ酸などの厚い壁および補助ポリマーに対応するために、酵素の選択および消化時間の長さの点で変更されなければならない。このプロトコルの最初の酵素は、外膜リポタンパク質(ブラウンのリポタンパク質、またはLppなど)をペプチドグリカンに切断し、それによって細胞壁からLppのC末端ジ(またはトリ)ペプチドを除くすべてを放出する。このステップは腸内細菌を調べるときに必要ですが、他の多くのグラム陰性菌にはLpp相当物がないため、このステップはスキップできます。第2酵素は、ペプチドグリカンのムラミン酸成分の後に特異的に切断し、ムロペプチド種を形成する二糖サブユニットを可溶化する。PGのアーキテクチャの正確な評価を提供するために、クロスブリッジまたはペプチドステムの他の部分の切断を防ぐために、サキュリを消化する際に注意する必要があります。
100種以上の菌種からペプチドグリカンの化学組成をHPLCで分析したが、UPLC技術では分析は行われていない。さらに、以前の研究では、細菌ドメインのごく一部からペプチドグリカンを特徴付けており、一部はHPLCのスループットによって制限されています。したがって、この方法をできるだけ多くの研究者に広め、UPLCプラットフォーム上での実施は、ペプチドグリカンがまだ分類されていない細菌種の大部分の生理学的研究を促進するために重要である。
Protocol
Representative Results
Discussion
この手順の重要なステップは、サンプル調製の2日目のステップ3.1です。SDSが一晩沈殿した場合、またはサンプルが室温で数週間4%のSDSに保存されている場合、サンプルを再溶解させるために少なくとも1時間再沸騰させる必要があります。SDS沈殿の一般的な原因はカリウム塩を含む培地の使用であるため、可能であればカリウムは培地で避けるべきです。代表結果セクションで述べたように、…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIHディレクターの新しいイノベーター賞DP2OD006466(K.C.H.)によって支えられていました。 著者らは、この方法の実践的なデモンストレーションと科学的な議論のためにラッセル・モンズに感謝する。
Materials
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler | |||
References
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