Isolierung und Vorbereitung von bakteriellen Zellwänden für die Kompositionsanalyse durch Ultra Performance Liquid Chromatographie
Summary
Die bakterielle Zellwand besteht aus Peptidoglycan, einem makromolekularen Netzwerk von Zuckersträngen, die durch Peptide vernetzt sind. Ultra Performance Liquid Chromatography bietet eine hohe Auflösung und Durchsatz für neuartige Entdeckungen der Peptidoglykan-Zusammensetzung. Wir präsentieren ein Verfahren zur Isolierung von Zellwänden (Sacculi) und deren anschließender Vorbereitung auf die Analyse über UPLC.
Abstract
Die bakterielle Zellwand ist entscheidend für die Bestimmung der Zellform während des Wachstums und der Teilung, und bewahrt die mechanische Integrität der Zellen im Angesicht von Turgordrücken mehrere Atmosphären in der Größe. Über die verschiedenen Formen und Größen des bakteriellen Königreichs hinweg besteht die Zellwand aus Peptidoglykan, einem makromolekularen Netzwerk von Zuckersträngen, die durch kurze Peptide vernetzt sind. Peptidoglycans zentrale Bedeutung für die bakterielle Physiologie liegt seiner Verwendung als Antibiotikum-Ziel zugrunde und hat genetische, strukturelle und zellbiologische Studien motiviert, wie es während des Wachstums und der Teilung robust zusammengesetzt wird. Dennoch sind noch umfangreiche Untersuchungen erforderlich, um die wichtigsten enzymatischen Aktivitäten in der Peptidoglykan-Synthese und die chemische Zusammensetzung von bakteriellen Zellwänden vollständig zu charakterisieren. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ist eine leistungsstarke analytische Methode zur Quantifizierung von Unterschieden in der chemischen Zusammensetzung der Wände von Bakterien, die unter einer Vielzahl von ökologischen und genetischen Bedingungen angebaut werden, aber sein Durchsatz ist oft begrenzt. Hier stellen wir ein einfaches Verfahren zur Isolierung und Herstellung von bakteriellen Zellwänden für biologische Analysen von Peptidoglycan über HPLC und Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) vor, eine Erweiterung von HPLC, die Pumpen verwendet, um ultrahohe Drücke von bis zu 15.000 psi zu liefern, verglichen mit 6.000 psi für HPLC. In Kombination mit der hier vorgestellten Herstellung von bakteriellen Zellwänden ermöglichen die probengeringen Injektoren, Detektoren mit hohen Abtastraten, kleineren Probenvolumina und kürzeren Laufzeiten von UPLC eine hohe Auflösung und einen Durchsatz für neuartige Entdeckungen der Peptidoglykanzusammensetzung und grundlegende bakterielle Zellbiologie in den meisten biologischen Laboratorien mit Zugang zu einer Ultrazentrifuge und UPLC.
Introduction
Das Ziel der hier beschriebenen Methode ist es, intakte bakterielle Zellwände (Sacculi) zu isolieren und das Peptidoglycan (PG) so zu verdauen, dass Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) verwendet werden kann, um Informationen wie die Identität der Muropeptidkomponenten und ihre Konzentrationen, die durchschnittliche Länge der Glykan-Stränge und den Anteil des Materials, das an Querverbindungen zwischen Strängen beteiligt ist, bereitzustellen. Für eine detaillierte Diskussion der PG Biochemie und Mutropptinatsarten, gibt es mehrere ausgezeichnete Bewertungen, die PG-Struktur und seine Rolle bei Infektion, Resistenz, Morphogenese und Wachstumbeschreiben 1-6. Die High Performance Liquid Chromatography (HPLC) für die PG-Analyse wurde ursprünglich von Glauner und Schwarz in den 1980er Jahren entwickelt und in jüngerer Zeit in den Laboren von Miguel de Pedro und Waldemar Vollmer umfassend aufgetragen. Frühere Methoden verwendeten Aminosäureanalyse oder Papierchromatographie, zeitaufwändige und mühsame Techniken, die keine genaue oder vollständige Bewertung von Zellwandkomponenten liefern.
Die UPLC-Analyse kann einfach in jedem Basisforschungslabor implementiert werden, das Zugriff auf eine Ultrazentrifuge und UPLC hat. Die UPLC-Methode, die wir unten vorstellen, isoliert vollständige Sacculi und liefert so umfassende, quantitative Informationen über alle darin enthaltenen chemischen Arten. Diese Methode liefert eine präzise Quantifizierung aller Muropeptide über eine Bakterienpopulation, alle innerhalb eines 20-min-UPLC-Laufs. Die Umsetzung dieser Methode beinhaltet nur grundlegende Laborfertigkeiten, ohne nennenswerte finanzielle Investitionen in Materialien. Um die Schritte in dieser Methode auszuführen, müssen die Forscher nur in pipettieren, Puffer und Enzyme vorbereiten und den pH-Wert anpassen, um es für eine Breite von wissenschaftlichen Disziplinen zugänglich zu machen. Die Wahl der in diesem Protokoll verwendeten Enzyme hängt von der analysierten Bakterienart ab; das hier beschriebene Protokoll ist nützlich für Escherichia coliund hat sich im Allgemeinen als ausreichend für die Isolierung von Sacculi von anderen Gram-negativen Organismen erwiesen. Die Konsultation der Literatur wird empfohlen, wenn diese Methode auf Gram-positive Bakterien angewendet wird; bei diesen Arten ist die Sacculus-Reinigung traditionell schwieriger. Insbesondere kann diese Methode in Bezug auf Enzymwahl und Länge der Verdauungszeiten geändert werden müssen, um die dickeren Wände und Zubehörpolymere wie Teichosäuren von Gram-positiven Bakterien unterzubringen. Das erste Enzym in diesem Protokoll spaltet die an der Peptidoglykan-Anlage des Peptidoglykans angebrachte Anhaftung des äußeren Membranlipoproteins (wie Brauns Lipoprotein oder Lpp) und löst damit bis auf das C-terminale Di- (oder Tri-) Peptid des Lpp von der Zellwand. Dieser Schritt ist notwendig bei der Untersuchung enterobacteria, aber viele andere Gram-negative Bakterien haben keine Lpp-Äquivalente, und daher kann dieser Schritt übersprungen werden. Ein zweites Enzym spaltet speziell nach der Muramicsäurekomponente des Peptidoglykans und llüflisiert die Disaccharid-Untereinheit, die die Muropeptid-Arten bildet. Um eine genaue Bewertung der Architektur des PG zu liefern, sollte bei der Verdauung der Sacculi darauf geachtet werden, eine Spaltung der Querbrücken oder eines anderen Teils des Peptidstamms zu verhindern.
Obwohl die chemischen Zusammensetzungen von Peptidoglycan aus über 100 Stämmen von 40 Bakterienarten mit HPLC analysiert wurden, wurden keine Analysen mit UPLC-Technologie durchgeführt. Darüber hinaus hat die vorherige Arbeit Peptidoglycan nur von einem kleinen Bruchteil der bakteriellen Domäne charakterisiert, teilweise durch den Durchsatz von HPLC begrenzt. Daher wird die Verbreitung dieser Methode an so viele Forscher wie möglich und die Implementierung auf UPLC-Plattformen entscheidend für die Förderung physiologischer Studien des großen Anteils von Bakterienarten sein, deren Peptidoglycan noch kategorisiert werden muss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren ist Schritt 3.1 des zweiten Tages der Probenvorbereitung. Wenn die SDS über Nacht gefällt hat oder wenn die Proben mehrere Wochen lang in 4% SDS bei Raumtemperatur gelagert wurden, müssen die Proben mindestens 1 Stunde neu geölt werden, um die SDS wieder aufzulösen. Eine häufige Ursache für SDS-Fällung ist die Verwendung von Medien mit Kaliumsalzen, daher sollte Kalium möglichst in Medien vermieden werden. Wie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse erwähnt, ist es auch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den NIH Director es New Innovator Award DP2OD006466 (nach K.C.H.) unterstützt. Die Autoren danken Russell Monds für eine praktische Demonstration der Methode und für wissenschaftliche Diskussionen.
Materials
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler | |||
References
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