Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento
Summary
La pared celular bacteriana está compuesta de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos. La cromatografía líquida de ultra rendimiento proporciona alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicanos. Presentamos un procedimiento para el aislamiento de las paredes celulares (sacculi) y su posterior preparación para su análisis a través de UPLC.
Abstract
La pared celular bacteriana es crítica para la determinación de la forma celular durante el crecimiento y la división, y mantiene la integridad mecánica de las células frente a presiones de turgencia de varias atmósferas en magnitud. A través de las diversas formas y tamaños del reino bacteriano, la pared celular se compone de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos cortos. La importancia central del peptidoglicano para la fisiología bacteriana subyace a su uso como diana antibiótica y ha motivado estudios genéticos, estructurales y biológicos celulares de cómo se ensambla robustamente durante el crecimiento y la división. No obstante, las investigaciones extensas todavía se requieren caracterizar completamente las actividades enzimáticas dominantes en síntesis del peptidoglycan y la composición química de paredes celulares bacterianas. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es un poderoso método analítico para cuantificar las diferencias en la composición química de las paredes de las bacterias cultivadas bajo una variedad de condiciones ambientales y genéticas, pero su rendimiento a menudo es limitado. Aquí, presentamos un procedimiento sencillo para el aislamiento y la preparación de paredes celulares bacterianas para análisis biológicos de peptidoglicano a través de HPLC y Cromatografía Líquida de Ultra Rendimiento (UPLC), una extensión de HPLC que utiliza bombas para entregar presiones ultra altas de hasta 15,000 psi, en comparación con 6,000 psi para HPLC. En combinación con la preparación de las paredes celulares bacterianas presentadas aquí, los inyectores de muestras de bajo volumen, los detectores con altas tasas de muestreo, volúmenes de muestra más pequeños y tiempos de ejecución más cortos de UPLC permitirán una alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicano y la biología celular bacteriana fundamental en la mayoría de los laboratorios biológicos con acceso a una ultracentrífuga y UPLC.
Introduction
El objetivo del método descrito en este documento es aislar las paredes celulares bacterianas intactas (sacculi) y digerir el peptidoglicano (PG) de modo que la cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) se pueda utilizar para proporcionar información como la identidad de los componentes muropeptide y sus concentraciones, la longitud promedio de las hebras de glicanos y la fracción de material involucrado en los reticulados entre las hebras. Para una discusión detallada de la bioquímica pg y las especies de muropeptide, hay varias revisiones excelentes que describen la estructura pg y su papel en la infección, resistencia, morfogénesis, y el crecimiento1-6. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para el análisis de PG fue desarrollada inicialmente por Glauner y Schwarz en la década de 1980, y más recientemente se ha mejorado y aplicado ampliamente en los laboratorios de Miguel de Pedro y Waldemar Vollmer. Los métodos anteriores utilizaron análisis de aminoácidos o cromatografía de papel, técnicas lentas y tediosas que no producen evaluaciones precisas o completas de los componentes de la pared celular.
El análisis uplc se puede implementar fácilmente en cualquier laboratorio de investigación básica que tenga acceso a una ultracentrífuga y UPLC. El método UPLC que presentamos a continuación aísla sacculi completo, proporcionando así información completa y cuantitativa sobre todas las especies químicas en él. Este método produce una cuantificación precisa de todos los muropeptides a través de una población de bacterias, todo dentro de una ejecución de UPLC de 20 minutos. La implementación de este método implica sólo habilidades básicas de laboratorio, sin una inversión financiera significativa en materiales. Para ejecutar los pasos de este método, los investigadores solo necesitan ser expertos en pipetear, preparar tampones y enzimas, y ajustar el pH, haciéndolo accesible a una amplia gama de disciplinas científicas. La elección de las enzimas utilizadas en este protocolo depende de la especie de bacteria que se está analizando; el protocolo descrito aquí es útil para Escherichia coli,y se ha encontrado generalmente para ser adecuado para aislar sacculi de otros organismos gramnegativos. La consulta con la literatura se recomienda al aplicar este método a las bacterias Gram-positivas; en estas especies, la purificación de sacculus ha sido tradicionalmente más difícil. En particular, este método puede tener que ser alterado en términos de elección de enzimas y la duración de los tiempos de digestión para acomodar las paredes más gruesas y los polímeros accesorios como los ácidos teicoicos de las bacterias Gram-positivas. La primera enzima en este protocolo escinde la lipoproteína externa de la membrana (tal como lipoproteína de Braun, o Lpp) accesorio al peptidoglycan, de tal modo liberando todo pero el C-terminal di- (o tri-) péptido del Lpp de la pared celular. Este paso es necesario al examinar enterobacterias, pero muchas otras bacterias Gram-negativas no tienen equivalentes de Lpp, y por lo tanto este paso se puede omitir. Una segunda enzima se escinde específicamente después del componente de ácido murámico del peptidoglicano, solubilizando la subunidad disacárido que forma la especie muropeptide. Para proporcionar una evaluación precisa de la arquitectura de la PG, se debe tener cuidado al digerir los sacculi para evitar la escisión de los puentes cruzados o cualquier otra parte del tallo del péptido.
Aunque las composiciones químicas de peptidoglicano de más de 100 cepas de ~ 40 especies bacterianas han sido analizadas por HPLC, no se han realizado análisis con la tecnología UPLC. Además, el trabajo anterior ha caracterizado peptidoglicano de sólo una pequeña fracción del dominio bacteriano, en parte limitado por el rendimiento de hplc. Por lo tanto, la difusión de este método a tantos investigadores como sea posible, y la implementación en las plataformas uplc, será fundamental para impulsar los estudios fisiológicos de la gran fracción de especies bacterianas cuyo peptidoglicano aún no ha sido categorizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un paso crítico en este procedimiento es el paso 3.1 del segundo día de preparación de la muestra. Si el SDS se ha precipitado durante la noche, o si las muestras se han almacenado en SDS al 4% durante varias semanas a temperatura ambiente, las muestras deben reboiled durante al menos 1 hora para volver a resolver el SDS. Una causa común de precipitación de SDS es el uso de medios con sales de potasio, por lo que el potasio debe evitarse en los medios si es posible. Como se mencionó en la sección resultados repres…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Premio al Nuevo Innovador del Director de los NIH DP2OD006466 (a K.C.H.). Los autores agradecen a Russell Monds por una demostración práctica del método y por las discusiones científicas.
Materials
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler | |||
References
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