Isolement et préparation de parois cellulaires bactériennes pour l’analyse de composition par chromatographie liquide ultra-performante
Summary
La paroi cellulaire bactérienne est composée de peptidoglycane, un réseau macromoléculaire de brins de sucre réticulés par des peptides. La chromatographie liquide ultra-performante offre une résolution et un débit élevés pour de nouvelles découvertes de composition de peptidoglycane. Nous présentons un procédé pour l’isolement des murs de cellules (sacculi) et leur préparation suivante pour l’analyse par l’intermédiaire d’UPLC.
Abstract
La paroi cellulaire bactérienne est essentielle pour la détermination de la forme cellulaire pendant la croissance et la division, et maintient l’intégrité mécanique des cellules face aux pressions de la turgescence de plusieurs atmosphères en magnitude. À travers les différentes formes et tailles du règne bactérien, la paroi cellulaire est composée de peptidoglycane, un réseau macromoléculaire de brins de sucre réticulés par de courts peptides. L’importance centrale du peptidoglycane pour la physiologie bactérienne sous-tend son utilisation en tant que cible antibiotique et a motivé des études génétiques, structurelles et biologiques cellulaires sur la façon dont il est solidement assemblé pendant la croissance et la division. Néanmoins, des investigations approfondies sont encore nécessaires pour caractériser pleinement les activités enzymatiques clés dans la synthèse du peptidoglycane et la composition chimique des parois cellulaires bactériennes. La chromatographie liquide à haute performance (CLHP) est une méthode d’analyse puissante pour quantifier les différences dans la composition chimique des parois des bactéries cultivées dans diverses conditions environnementales et génétiques, mais son débit est souvent limité. Ici, nous présentons une procédure simple pour l’isolement et la préparation des parois cellulaires bactériennes pour les analyses biologiques du peptidoglycane via HPLC et ultra performance chromatographie liquide (UPLC), une extension de HPLC qui utilise des pompes pour fournir des pressions ultra-élevées allant jusqu’à 15 000 psi, par rapport à 6 000 psi pour HPLC. En combinaison avec la préparation des parois cellulaires bactériennes présentée ici, les injecteurs d’échantillons à faible volume, les détecteurs avec des taux d’échantillonnage élevés, des volumes d’échantillons plus petits et des temps d’exécution plus courts de l’UPLC permettront une résolution et un débit élevés pour de nouvelles découvertes de composition de peptidoglycane et de biologie cellulaire bactérienne fondamentale dans la plupart des laboratoires biologiques ayant accès à une ultracentrifuge et à un UPLC.
Introduction
Le but de la méthode décrite ici est d’isoler les parois cellulaires bactériennes intactes (sacculi) et de digérer le peptidoglycane (PG) de telle sorte que la chromatographie liquide ultra-performante (UPLC) peut être utilisée pour fournir des informations telles que l’identité des composants muropeptides et leurs concentrations, la longueur moyenne des brins de glycane, et la fraction de matériau impliquée dans les réticulations entre les brins. Pour une discussion détaillée de la biochimie PG et des espèces de muropeptides, il existe plusieurs excellentes revues qui décrivent la structure de PG et son rôle dans l’infection, la résistance, la morphogenèse et la croissance1-6. La chromatographie liquide haute performance (HPLC) pour l’analyse PG a été initialement développée par Glauner et Schwarz dans les années 1980, et plus récemment a été améliorée et largement appliquée dans les laboratoires de Miguel de Pedro et Waldemar Vollmer. Les méthodes précédentes utilisaient l’analyse d’acides aminés ou la chromatographie sur papier, des techniques fastidieuses et fastidieuses qui ne donnent pas d’évaluations précises ou complètes des composants de la paroi cellulaire.
L’analyse UPLC peut être facilement mise en œuvre dans n’importe quel laboratoire de recherche fondamentale ayant accès à un ultracentrifuge et à un UPLC. La méthode UPLC que nous présentons ci-dessous isole des sacculi complets, fournissant ainsi des informations quantitatives complètes sur toutes les espèces chimiques qui s’y trouvent. Cette méthode donne une quantification précise de tous les muropeptides à travers une population de bactéries, le tout dans un run UPLC de 20 minutes. La mise en œuvre de cette méthode n’implique que des compétences de laboratoire de base, sans investissement financier important dans les matériaux. Pour exécuter les étapes de cette méthode, les chercheurs n’ont qu’à être qualifiés pour pipetter, préparer des tampons et des enzymes et ajuster le pH, le rendant accessible à un large éventail de disciplines scientifiques. Le choix des enzymes utilisées dans ce protocole dépend de l’espèce de bactérie analysée; le protocole décrit ici est utile pour Escherichia coli,et s’est généralement avéré adéquat pour isoler des sacculi d’autres organizations Gram négatif. Il est recommandé de consulter la littérature lors de l’application de cette méthode aux bactéries à Gram positif; chez ces espèces, la purification du sacculus a traditionnellement été plus difficile. En particulier, cette méthode peut devoir être modifiée en termes de choix d’enzymes et de durée de digestion pour s’adapter aux parois plus épaisses et aux polymères accessoires tels que les acides téichoïques des bactéries à Gram positif. La première enzyme de ce protocole fend la lipoprotéine membranaire externe (telle que la lipoprotéine de Braun, ou Lpp) attachement au peptidoglycane, libérant ainsi tout sauf le peptide di- (ou tri-) C-terminal du Lpp de la paroi cellulaire. Cette étape est nécessaire lors de l’examen des entérobactéries, mais de nombreuses autres bactéries à Gram négatif n’ont pas d’équivalents Lpp, et donc cette étape peut être ignorée. Une deuxième enzyme se fend spécifiquement après le composant acide muramique du peptidoglycane, solubilisant la sous-unité disaccharide qui forme l’espèce muropeptide. Pour fournir une évaluation précise de l’architecture du PG, des précautions doivent être prises en digérant les sacculi pour empêcher le clivage des ponts croisés ou de toute autre partie de la tige peptidique.
Bien que les compositions chimiques du peptidoglycane provenant de plus de 100 souches d’environ 40 espèces bactériennes aient été analysées par HPLC, aucune analyse n’a été effectuée avec la technologie UPLC. En outre, des travaux antérieurs ont caractérisé le peptidoglycane à partir d’une petite fraction du domaine bactérien, en partie limitée par le débit de HPLC. Par conséquent, la diffusion de cette méthode au plus grand nombre de chercheurs possible, et sa mise en œuvre sur les plateformes UPLC, seront essentielles pour conduire des études physiologiques de la grande fraction d’espèces bactériennes dont le peptidoglycane n’a pas encore été catégorisé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une étape critique de cette procédure est l’étape 3.1 du deuxième jour de préparation de l’échantillon. Si la FDS a précipité pendant la nuit, ou si les échantillons ont été stockés dans une FDS à 4 % pendant plusieurs semaines à température ambiante, les échantillons doivent être rediffusés pendant au moins 1 heure pour dissoudre la FDS. Une cause fréquente de précipitation de la FDS est l’utilisation de milieux avec des sels de potassium, de sorte que le potassium doit être évité dans les m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le prix du nouvel innovateur du directeur des NIH DP2OD006466 (à K.C.H.). Les auteurs remercient Russell Monds pour une démonstration pratique de la méthode et pour les discussions scientifiques.
Materials
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler | |||
References
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