בידוד והכנת קירות תא חיידקי לניתוח קומפוזיציוני על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים
Summary
דופן התא החיידקי מורכבת מפפטידוגליקן, רשת מקרומולקולרית של גדילי סוכר המוצלבים על ידי פפטידים. כרומטוגרפיה נוזלית עם ביצועים גבוהים מספקת רזולוציה גבוהה ותפוקה לגילויים חדשניים של הרכב פפטידוגליקני. אנו מציגים הליך לבידוד קירות התא (sacculi) והכנתם לאחר מכן לניתוח באמצעות UPLC.
Abstract
דופן התא החיידקי היא קריטית לקביעת צורת התא במהלך הצמיחה והחלוקה, ושומרת על השלמות המכנית של התאים לנוכח לחצים טורגורים מספר אטמוספרות בעוצמה. על פני הצורות והגדלים המגוונים של ממלכת החיידקים, קיר התא מורכב מפפטידוגליקן, רשת מקרומולקולרית של גדילי סוכר המחוברים על ידי פפטידים קצרים. החשיבות המרכזית של Peptidoglycan לפיזיולוגיה חיידקית עומדת ביסוד השימוש בו כמטרה אנטיביוטית והניעה מחקרים ביולוגיים גנטיים, מבניים ותאיים של האופן שבו הוא מורכב באופן איתן במהלך צמיחה וחלוקה. עם זאת, עדיין נדרשות חקירות מקיפות כדי לאפיין באופן מלא את הפעילות האנזימטית העיקרית בסינתזה פפטידוגליקנית ואת ההרכב הכימי של קירות התא החיידקי. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) היא שיטה אנליטית רבת עוצמה לכימות הבדלים בהרכב הכימי של קירות החיידקים הגדלים תחת מגוון תנאים סביבתיים וגנטיים, אך התפוקה שלה מוגבלת לעתים קרובות. כאן, אנו מציגים הליך פשוט לבידוד והכנת קירות תא חיידקי לניתוחים ביולוגיים של פפטידוגליקן באמצעות HPLC ו כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC), הרחבה של HPLC המשתמשת במשאבות כדי לספק לחצים גבוהים במיוחד של עד 15,000 psi, לעומת 6,000 psi עבור HPLC. בשילוב עם הכנת קירות תא חיידקי המוצגים כאן, מזרקי המדגם בנפח נמוך, גלאים עם שיעורי דגימה גבוהים, נפחי מדגם קטנים יותר וזמני ריצה קצרים יותר של UPLC יאפשרו רזולוציה גבוהה ותפוקה לגילויים חדשים של הרכב פפטידוגליקני וביולוגיה בסיסית של תאי חיידקים ברוב המעבדות הביולוגיות עם גישה לאולטרה-סנטריפוג ו- UPLC.
Introduction
מטרת השיטה המתוארת במסמך זה היא לבודד קירות תא חיידקי שלמים (sacculi) ולעכל את הפפטידוגליקן (PG) כך שניתן יהיה להשתמש בכרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC) כדי לספק מידע כגון זהותם של רכיבי muropeptide וריכוזיהם, האורך הממוצע של גדילי הגליקן, ושבריר החומר המעורב בקישורים צולבים בין גדילים. לדיון מפורט על ביוכימיה PG ומינים muropeptide, ישנן מספר ביקורות מצוינות המתארות מבנה PG ותפקידה זיהום, התנגדות, morphogenesis, וצמיחה1-6. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) לניתוח PG פותחה בתחילה על ידי גלונר ושוורץ בשנות השמונים, ולאחרונה שופרה ויושמתה בהרחבה במעבדות של מיגל דה פדרו ו-וולדמר וולמר. שיטות קודמות השתמשו בניתוח חומצות אמינו או כרומטוגרפיה של נייר, טכניקות גוזלות זמן ומייגעות שאינן מניבות הערכות מדויקות או מלאות של רכיבי קיר התא.
ניתוח UPLC ניתן ליישם בקלות בכל מעבדת מחקר בסיסית שיש לה גישה ultracentrifuge ו UPLC. שיטת UPLC שאנו מציגים להלן מבודדת sacculi שלם, ובכך מספקת מידע מקיף, כמותי על כל המינים הכימיים בו. שיטה זו מניבה כימות מדויק של כל muropeptides על פני אוכלוסייה של חיידקים, כל בתוך 20 דקות UPLC לרוץ. יישום שיטה זו כרוך בכישורי מעבדה בסיסיים בלבד, ללא השקעה כספית משמעותית בחומרים. על מנת לבצע את השלבים בשיטה זו, החוקרים צריכים להיות מיומנים רק בצנרת, הכנת מאגרים ואנזימים, והתאמת ה- pH, מה שהופך אותו לנגיש למגוון רחב של דיסציפלינות מדעיות. הבחירה של אנזימים המשמשים בפרוטוקול זה תלויה במין החיידק המנותח; הפרוטוקול המתואר כאן שימושי עבור Escherichia coli, ובדרך כלל נמצא כי הוא מתאים לבודד sacculi מאורגניזמים אחרים גראם שלילי. התייעצות עם הספרות מומלצת בעת יישום שיטה זו על חיידקים גראם חיובי; במינים אלה, טיהור סקולוס באופן מסורתי היה קשה יותר. בפרט, שיטה זו עשויה להיות צריכה להיות שונה במונחים של בחירת אנזים ואורך זמני העיכול כדי להתאים את הקירות העבים פולימרים אביזר כגון חומצות teichoic של חיידקים גראם חיובי. האנזים הראשון בפרוטוקול זה מבקע ליפופרוטאין קרום החיצוני (כגון ליפופרוטאין של בראון, או Lpp) מצורף פפטידוגליקן, ובכך משחרר את כל אבל C-terminal di- (או תלת)פפטיד של Lpp מקיר התא. שלב זה נחוץ בעת בחינת Enterobacteria, אבל חיידקים רבים אחרים גראם שלילי אין מקבילות Lpp, ולכן צעד זה ניתן לדלג. אנזים שני נצמד במיוחד לאחר רכיב החומצה המורמית של הפפטידוגליקן, ומזלזל בתת-המין disaccharide היוצר את מינים muropeptide. כדי לספק הערכה מדויקת של הארכיטקטורה של PG, יש להקפיד על עיכול sacculi כדי למנוע מחשוף של הגשרים או כל חלק אחר של גזע פפטיד.
למרות ההרכבים הכימיים של peptidoglycan מעל 100 זנים של ~ 40 מינים חיידקיים נותחו על ידי HPLC, לא בוצעו ניתוחים עם טכנולוגיית UPLC. בנוסף, עבודה קודמת אפיינה peptidoglycan רק חלק קטן של התחום החיידקי, בחלקו מוגבל על ידי התפוקה של HPLC. לכן, הפצת שיטה זו לחוקרים רבים ככל האפשר, ויישום על פלטפורמות UPLC, יהיה קריטי להנעת מחקרים פיזיולוגיים של חלק גדול של מיני חיידקים אשר peptidoglycan עדיין לא סווג.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלב קריטי בהליך זה הוא שלב 3.1 של היום השני של הכנת מדגם. אם SDS יש זירז לילה, או אם הדגימות אוחסנו 4% SDS במשך כמה שבועות בטמפרטורת החדר, הדגימות חייבות להיות reboiled לפחות 1 שעה כדי לפתור מחדש את SDS. סיבה נפוצה עבור משקעים SDS היא השימוש במדיה עם מלחי אשלגן, ולכן אשלגן יש להימנע במדיה במידת האפשר. כפי שצ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרס החדשנות החדש של מנהל NIH DP2OD006466 (ל K.C.H.). המחברים מודים לראסל מונדס על הדגמה מעשית של השיטה ועל דיונים מדעיים.
Materials
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler | |||
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. The Composition of the murein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D’Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. . The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
