Изоляция и подготовка бактериальных клеточных стенок для композиционного анализа с помощью ультра производительности жидкой хроматографии
Summary
Бактериальная клеточная стенка состоит из пептидогликана, макромолекулярной сети сахарных нитей, скрещенных пептидами. Ультра производительности жидкой хроматографии обеспечивает высокое разрешение и пропускную способность для новых открытий пептидогликан композиции. Мы представляем процедуру изоляции клеточных стенок (саккули) и их последующей подготовки к анализу через UPLC.
Abstract
Бактериальная клеточная стенка имеет решающее значение для определения формы клеток во время роста и деления, и поддерживает механическую целостность клеток перед лицом тургорного давления нескольких атмосфер в величине. По всей разнообразной формы и размеров бактериального царства, клеточная стенка состоит из пептидоглифа, макромолекулярной сети сахарных нитей, скрещенных короткими пептидами. Центральное значение Peptidoglycan для бактериальной физиологии лежит в основе его использования в качестве цели антибиотиков и мотивировано генетических, структурных и клеточных биологических исследований о том, как он надежно собраны во время роста и деления. Тем не менее, по-прежнему необходимы обширные исследования для полной характеристики ключевых энзиматических действий в синтезе пептидогликана и химического состава стенок бактериальных клеток. Высокой производительности жидкой хроматографии (HPLC) является мощным аналитическим методом для количественной оценки различий в химическом составе стен бактерий, выращенных в различных экологических и генетических условиях, но его пропускная способность часто ограничена. Здесь мы представляем простую процедуру изоляции и подготовки бактериальных клеточных стенок для биологического анализа пептидогликана через HPLC и Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), расширение HPLC, которая использует насосы для доставки сверхвысокого давления до 15000 пси, по сравнению с 6000 пси для HPLC. В сочетании с подготовкой бактериальных клеточных стенок, представленных здесь, малообнакоченные инжекторы образца, детекторы с высокими показателями отбора проб, меньшие объемы выборки и более короткие сроки ведения UPLC позволят получить высокое разрешение и пропускную способность для новых открытий пептидогликанового состава и фундаментальной биологии бактериальных клеток в большинстве биологических лабораторий с доступом к ультрацентрифугу и UPLC.
Introduction
Цель метода, описанного в настоящем, заключается в том, чтобы изолировать нетронутыми стенки бактериальных клеток (sacculi) и переварить пептидогликан (PG) таким образом, что Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) может быть использован для предоставления информации, такой как идентичность компонентов муропептида и их концентрации, средняя длина гликановых нитей, и доля материала, участвуют в перекрестных нитей. Для детального обсуждения биохимии PG и видов муропептида, Есть несколько прекрасных обзоров, которые описывают структуру PG и ее роль в инфекции, устойчивость, морфогенез,и рост 1-6. Высокой производительности жидкой хроматографии (HPLC) для анализа PG был первоначально разработан Глаунер и Шварц в 1980-х годах, а в последнее время был расширен и широко применяется в лабораториях Мигель де Педро и Вальдемар Фолльмер. Предыдущие методы использовали аминокислотный анализ или бумажную хроматографию, трудоемкие и утомительные методы, которые не дают точных или полных оценок компонентов клеточной стенки.
Анализ UPLC может быть легко реализован в любой лаборатории фундаментальных исследований, которая имеет доступ к ультрацентрифугу и UPLC. Метод UPLC, который мы представляем ниже, изолирует полный мешок, тем самым предоставляя всеобъемлющую, количественную информацию по всем химическим видам в них. Этот метод дает точную количественную оценку всех муропептидов по всей популяции бактерий, все в течение 20 мин UPLC перспективе. Внедрение этого метода предполагает только базовые лабораторные навыки, без значительных финансовых вложений в материалы. Для того, чтобы выполнить шаги в этом методе, исследователи должны быть квалифицированы только в трубопроводе, подготовка буферов и ферментов, и корректировка рН, что делает его доступным для широкого круга научных дисциплин. Выбор ферментов, используемых в этом протоколе, зависит от анализируемых видов бактерий; протокол, описанный здесь, полезен для кишечной палочки,и, как правило, было установлено, что достаточно для изоляции саккули от других грам-отрицательных организмов. Консультации с литературой рекомендуется при применении этого метода к грамположительных бактерий; в этих видах, sacculus очистки традиционно было сложнее. В частности, этот метод, возможно, придется изменить с точки зрения выбора ферментов и продолжительности времени пищеварения для размещения более толстых стенок и аксессуаров полимеров, таких как тейхойные кислоты грамположительных бактерий. Первый фермент в этом протоколе расщепляет внешний мембранный липопротеин (например, липопротеин Брауна, или Lpp) привязанность к пептиду, тем самым высвобождая все, кроме C-терминального ди- (или три)) пептида Lpp из клеточной стенки. Этот шаг необходим при изучении энтеробактерий, но многие другие грам-отрицательные бактерии не имеют эквивалентов Lpp, и поэтому этот шаг может быть пропущен. Второй фермент специально расщепляется после компонента мурамической кислоты пептидоглыкана, solubilizing disaccharide субъединит, который образует вид муропептида. Чтобы обеспечить точную оценку архитектуры PG, следует позаботиться о переваривании саккули, чтобы предотвратить расщепление кроссбриджей или любой другой части пептидного стебля.
Несмотря на то, что химические составы пептидогликана из более чем 100 штаммов бактериальных видов no40 были проанализированы HPLC, никаких анализов с помощью технологии UPLC не проводилось. Кроме того, предыдущая работа характеризовала пептидогликана лишь из небольшой доли бактериальной области, частично ограниченной пропускной способностью HPLC. Таким образом, распространение этого метода, как многие исследователи, как это возможно, и осуществление на платформах UPLC, будет иметь решающее значение для вождения физиологических исследований большой доли бактериальных видов, чьи пептидогликан до сих пор не классифицированы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важным шагом в этой процедуре является шаг 3.1 второго дня подготовки образца. Если SDS осаждается в одночасье, или если образцы хранились в 4% SDS в течение нескольких недель при комнатной температуре, образцы должны быть reboiled, по крайней мере 1 час, чтобы переокрасить SDS. Распространенной пр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана директором NIH Новый новатор премии DP2OD006466 (к K.C.H.). Авторы благодарят РасселаМондса за практическую демонстрацию метода и за научные дискуссии.
Materials
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler | |||
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. The Composition of the murein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D’Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. . The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
