Isolering og fremstilling av bakterielle cellevegger for komposisjonsanalyse ved ultraytelses væskekromatografi
Summary
Den bakterielle celleveggen består av peptidoglykan, et makromolekylært nettverk av sukkerstrenger krysskoblet av peptider. Ultra Ytelse Flytende kromatografi gir høy oppløsning og gjennomstrømning for nye funn av peptidoglykan sammensetning. Vi presenterer en prosedyre for isolering av cellevegger (sacculi) og deres påfølgende forberedelse til analyse via UPLC.
Abstract
Bakteriecelleveggen er kritisk for bestemmelse av celleform under vekst og divisjon, og opprettholder cellenes mekaniske integritet i møte med turgortrykk flere atmosfærer i størrelsesorden. På tvers av de forskjellige formene og størrelsene til bakterieriket består celleveggen av peptidoglykan, et makromolekylært nettverk av sukkerstrenger krysset av korte peptider. Peptidoglykanens sentrale betydning for bakteriefysiologi ligger til grunn for bruken som et antibiotikamål og har motivert genetiske, strukturelle og cellebiologiske studier av hvordan den er robust sammensatt under vekst og deling. Likevel er det fortsatt nødvendig med omfattende undersøkelser for å fullt ut karakterisere de viktigste enzymatiske aktivitetene i peptidoglykansyntese og kjemisk sammensetning av bakterielle cellevegger. Høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) er en kraftig analytisk metode for å kvantifisere forskjeller i kjemisk sammensetning av veggene i bakterier dyrket under en rekke miljømessige og genetiske forhold, men gjennomstrømningen er ofte begrenset. Her presenterer vi en enkel prosedyre for isolering og tilberedning av bakterielle cellevegger for biologiske analyser av peptidoglykan via HPLC og Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), en utvidelse av HPLC som bruker pumper for å levere ultrahøyt trykk på opptil 15 000 psi, sammenlignet med 6000 psi for HPLC. I kombinasjon med utarbeidelsen av bakterielle cellevegger presentert her, vil prøveinjektorene med lavt volum, detektorer med høye samplingsfrekvenser, mindre prøvevolumer og kortere kjøretider for UPLC muliggjøre høy oppløsning og gjennomstrømning for nye funn av peptidoglykansammensetning og grunnleggende bakteriell cellebiologi i de fleste biologiske laboratorier med tilgang til en ultracentrifuge og UPLC.
Introduction
Målet med metoden som er beskrevet her, er å isolere intakte bakterielle cellevegger (sacculi) og fordøye peptidoglykan (PG) slik at Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) kan brukes til å gi informasjon som identiteten til muropeptidkomponentene og deres konsentrasjoner, gjennomsnittlig lengde på glykanstrenger og brøkdelen av materiale involvert i krysskoblinger mellom tråder. For en detaljert diskusjon av PG biokjemi og muropeptide arter, er det flere gode vurderinger som beskriver PG-struktur og dens rolle i infeksjon, motstand, morfogenese og vekst1-6. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) for PG-analyse ble opprinnelig utviklet av Glauner og Schwarz på 1980-tallet, og har nylig blitt forbedret og anvendt mye i laboratoriene til Miguel de Pedro og Waldemar Vollmer. Tidligere metoder benyttet aminosyreanalyse eller papirkromatografi, tidkrevende og kjedelige teknikker som ikke gir nøyaktige eller fullstendige vurderinger av celleveggkomponenter.
UPLC-analyse kan enkelt implementeres i ethvert grunnleggende forskningslaboratorium som har tilgang til en ultracentrifuge og UPLC. UPLC-metoden som vi presenterer nedenfor isolerer komplett sacculi, og gir dermed omfattende, kvantitativ informasjon om alle kjemiske arter der. Denne metoden gir presis kvantifisering av alle muropeptider på tvers av en bakteriepopulasjon, alt innenfor en 20 min UPLC-løp. Implementeringen av denne metoden innebærer bare grunnleggende laboratorieferdigheter, uten betydelige økonomiske investeringer i materialer. For å utføre trinnene i denne metoden trenger forskere bare å være dyktige i pipettering, forberede buffere og enzymer, og justere pH, noe som gjør den tilgjengelig for et bredt spekter av vitenskapelige disipliner. Valget av enzymer som brukes i denne protokollen avhenger av arten av bakterie som analyseres; protokollen beskrevet her er nyttig for Escherichia coli, og har generelt vist seg å være tilstrekkelig for å isolere sacculi fra andre Gram-negative organismer. Konsultasjon med litteraturen anbefales ved bruk av denne metoden på Gram-positive bakterier; i disse artene har sacculus rensing tradisjonelt vært vanskeligere. Spesielt kan denne metoden måtte endres når det gjelder enzymvalg og fordøyelsestid for å imøtekomme de tykkere veggene og tilbehørspolymerene som teichoic syrer av Gram-positive bakterier. Det første enzymet i denne protokollen klemmer ytre membran lipoprotein (som Brauns lipoprotein, eller Lpp) vedlegg til peptidoglykanen, og frigjør dermed alle unntatt C-terminal di- (eller tri-) peptidet til Lpp fra celleveggen. Dette trinnet er nødvendig når du undersøker Enterobacteria, men mange andre Gram-negative bakterier har ingen Lpp-ekvivalenter, og derfor kan dette trinnet hoppes over. Et annet enzym cleaves spesielt etter denmuramiske syrekomponenten i peptidoglykanen, og oppløser disakkaridunderenheten som danner muropeptidarten. For å gi en nøyaktig vurdering av arkitekturen til PG, bør det tas hensyn til å fordøye sacculi for å forhindre spalting av kryssbroene eller andre deler av peptidstammen.
Selv om de kjemiske sammensetningene av peptidoglykan fra over 100 stammer av ~ 40 bakteriearter har blitt analysert av HPLC, er det ikke utført noen analyser med UPLC-teknologi. I tillegg har tidligere arbeid karakterisert peptidoglykan fra bare en liten brøkdel av bakteriedomenet, delvis begrenset av gjennomstrømningen til HPLC. Derfor vil formidling av denne metoden til så mange forskere som mulig, og implementering på UPLC-plattformer, være avgjørende for å drive fysiologiske studier av den store brøkdelen av bakteriearter hvis peptidoglykan ennå ikke er kategorisert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et kritisk trinn i denne prosedyren er trinn 3.1 i den andre dagen med prøvepreparering. Hvis SDS har utfelt over natten, eller hvis prøvene har vært lagret i 4% SDS i flere uker ved romtemperatur, må prøvene kokes i minst 1 time for å løse SDS. En vanlig årsak til SDS-nedbør er bruk av medier med kaliumsalter, så kalium bør unngås i media om mulig. Som nevnt i delen Representative Resultater, er det også viktig å justere pH til innenfor det isoelektriske punktet til muropeptider (~ 3,5), men ikke for mye l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH Director’s New Innovator Award DP2OD006466 (til K.C.H.). Forfatterne takker Russell Monds for en praktisk demonstrasjon av metoden og for vitenskapelige diskusjoner.
Materials
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler | |||
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. The Composition of the murein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D’Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. . The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
