Isolering och beredning av bakteriella cellväggar för kompositionsanalys av ultraprestanda flytande kromatografi
Summary
Bakteriecellväggen består av peptidoglykan, ett makromolekylärt nätverk av sockersträngar som är korslänkade av peptider. Ultra Performance Liquid Chromatography ger hög upplösning och genomströmning för nya upptäckter av peptidoglykankomposition. Vi presenterar ett förfarande för isolering av cellväggar (sacculi) och deras efterföljande förberedelse för analys via UPLC.
Abstract
Bakteriecellväggen är avgörande för bestämning av cellform under tillväxt och delning, och upprätthåller cellernas mekaniska integritet inför turgortryck flera atmosfärer i storlek. Över bakterieriket består cellväggen av peptidoglykan, ett makromolekylärt nätverk av sockersträngar som är korslänkade av korta peptider. Peptidoglycans centrala betydelse för bakteriefysiologi ligger till grund för dess användning som ett antibiotikummål och har motiverat genetiska, strukturella och cellbiologiska studier av hur den monteras robust under tillväxt och delning. Icke desto mindre krävs det fortfarande omfattande undersökningar för att fullt ut karakterisera de viktigaste enzymatiska aktiviteterna i peptidoglykansyntesen och den kemiska sammansättningen av bakteriecellsväggar. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) är en kraftfull analysmetod för att kvantifiera skillnader i den kemiska sammansättningen av väggarna i bakterier som odlas under en mängd olika miljömässiga och genetiska förhållanden, men dess genomströmning är ofta begränsad. Här presenterar vi ett enkelt förfarande för isolering och beredning av bakteriella cellväggar för biologiska analyser av peptidoglykan via HPLC och Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), en förlängning av HPLC som använder pumpar för att leverera ultrahögtryck på upp till 15 000 psi, jämfört med 6 000 psi för HPLC. I kombination med beredningen av bakteriella cellväggar som presenteras här, kommer lågvolymprovinjektorer, detektorer med hög samplingshastighet, mindre provvolymer och kortare körtider för UPLC att möjliggöra hög upplösning och genomströmning för nya upptäckter av peptidoglykansammansättning och grundläggande bakteriecellsbiologi i de flesta biologiska laboratorier med tillgång till en ultracentrifuge och UPLC.
Introduction
Målet med den metod som beskrivs häri är att isolera intakta bakteriecellväggar (sacculi) och att smälta peptidoglykanen (PG) så att Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) kan användas för att ge information som muropeptidkomponenternas identitet och deras koncentrationer, den genomsnittliga längden på glykansträngar och den del av materialet som är involverat i korslänkar mellan strängar. För en detaljerad diskussion om PG biokemi och muropeptide arter, Det finns flera utmärkta recensioner som beskriver PG struktur och dess roll i infektion, resistens, morfofilos, och tillväxt1-6. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) för PG-analys utvecklades ursprungligen av Glauner och Schwarz på 1980-talet, och har på senare tid förbättrats och tillämpats i stor utsträckning i laboratorierna miguel de Pedro och Waldemar Vollmer. Tidigare metoder använde aminosyra analys eller papper kromatografi, tidskrävande och tråkiga tekniker som inte ger exakta eller fullständiga bedömningar av cellvägg komponenter.
UPLC-analys kan enkelt implementeras i alla grundläggande forskningslaboratorier som har tillgång till en ultracentrifuge och UPLC. UPLC-metoden som vi presenterar nedan isolerar kompletta sacculi och ger därmed omfattande, kvantitativ information om alla kemiska arter däri. Denna metod ger exakt kvantifiering av alla muropeptider över en bakteriepopulation, allt inom en 20 minuters UPLC-körning. Genomförandet av denna metod omfattar endast grundläggande laboratoriefärdigheter, utan betydande ekonomiska investeringar i material. För att utföra stegen i denna metod behöver forskare bara vara skickliga på pipetting, förbereda buffertar och enzymer och justera pH, vilket gör det tillgängligt för ett brett spektrum av vetenskapliga discipliner. Valet av enzymer som används i detta protokoll beror på vilken bakterieart som analyseras; det protokoll som beskrivs här är användbart för Escherichia coli, och har i allmänhet visat sig vara tillräckligt för att isolera sacculi från andra Gram-negativa organismer. Samråd med litteraturen rekommenderas vid tillämpning av denna metod på grampositiva bakterier; I dessa arter har sacculus rening traditionellt varit svårare. I synnerhet kan denna metod behöva ändras när det gäller enzymval och matsmältningstid för att rymma de tjockare väggarna och tillbehörspolymerer som teichoicsyror av grampositiva bakterier. Det första enzymet i detta protokoll klyver yttre membran lipoprotein (såsom Brauns lipoprotein, eller Lpp) fastsättning i peptidoglykanen, vilket frigör alla utom C-terminal di- (eller tri-) peptiden av Lpp från cellväggen. Detta steg är nödvändigt vid undersökning av Enterobacteria, men många andra Gram-negativa bakterier har inga Lpp-motsvarigheter, och därför kan detta steg hoppas över. Ett andra enzym klyver specifikt efter peptidoglykanens muramsyrakomponent, vilket gör disackaridunderenheten löslig som bildar muropeptidarten. För att ge en korrekt bedömning av PG: s arkitektur bör man vara försiktig med att smälta sacculi för att förhindra klyvning av korsbroarna eller någon annan del av peptidstammen.
Även om de kemiska sammansättningarna av peptidoglykan från över 100 stammar av ~ 40 bakteriearter har analyserats av HPLC, har inga analyser utförts med UPLC-teknik. Dessutom har tidigare arbete karakteriserat peptidoglykan från endast en liten del av bakteriedomänen, delvis begränsad av genomströmningen av HPLC. Därför kommer spridning av denna metod till så många forskare som möjligt, och implementering på UPLC-plattformar, att vara avgörande för att driva fysiologiska studier av den stora andelen bakteriearter vars peptidoglykan ännu inte har kategoriserats.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett kritiskt steg i denna procedur är steg 3.1 av den andra dagen av provberedning. Om SDS har fällts ut över natten, eller om proverna har lagrats i 4% SDS i flera veckor vid rumstemperatur, måste proverna återboileras i minst 1 timme för att omissolve SDS. En vanlig orsak till SDS nederbörd är användningen av media med kaliumsalter, så kalium bör undvikas i media om möjligt. Som nämnts i avsnittet Representativa resultat är det också viktigt att justera pH-h:t till inom muropeptidens isoelektriska punkt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH Director’s New Innovator Award DP2OD006466 (till K.C.H.). Författarna tackar Russell Monds för en praktisk demonstration av metoden och för vetenskapliga diskussioner.
Materials
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler | |||
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. The Composition of the murein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D’Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. . The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
